[发明专利]一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶氨基酸序列的基础上，将第47位的氨基酸残基M突变为V，且将第109位的氨基酸残基N突变为I，得到了一种亮氨酸脱氢酶突变体(突变点为M47V，N109I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达该突变体的重组菌E.coli BL21‑pET28a‑BtLDH007单位菌体的亮氨酸脱氢酶酶活达到170.9U/g；以2‑酮丁酸为底物生产L‑2‑氨基丁酸的产量最高达到77.6g/L，转化率为96.0％。

技术领域

本发明涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，分子式为C₄H₉NO₂。L-2-氨基丁酸具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。同时L-2-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成。

目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化学法和生物法。化学法反应条件苛刻、易生成副产物，成本较高，不宜进行工业生产，同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。生物法合成L-2-氨基丁酸具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法又包括微生物发酵法和酶催化转化法。微生物发酵法专属性较强，条件温和，环境污染少，但发酵过程会产生与目标产物结构相似的副产物，反应产物成分复杂，后续分离困难。酶催化转化法其中一种是利用亮氨酸脱氢酶以2-酮丁酸为底物，合成L-2-氨基丁酸，这是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。但酶转化工艺多面临着酶活力低、产物浓度低、下游纯化成本高、工程放大难等问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第47位的氨基酸残基M突变为V，且将第109位的氨基酸残基N突变为I。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以pET28a为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种制备L-2-氨基丁酸的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，在NADH辅酶再生系统中以2-酮丁酸为底物制备L-2-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生体系是以甲酸铵为底物，通过甲酸脱氢酶将NAD⁺转化为NADH的辅酶再生系统。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是用所述基因工程菌的湿细胞进行转化。

在本发明的一种实施方式中，所述制备是使用pH为7.0～8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液作为缓冲体系，湿细胞添加量15～20g/L，2-酮丁酸添加75～80g/L，甲酸铵浓度为20～40g/L，NAD⁺浓度为0.4～1.0g/L，甲酸脱氢酶酶活为1000～1500U/L，转化温度30～40℃，转化8～12h。