[发明专利]一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法

说明书

本发明公开了一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法。该方法包括以下步骤：电荷异质体分离、电荷异质体收集、胶内酶切、糖链富集、糖链标记、糖链纯化、质谱分析。本发明发现等电聚焦电泳（IEF）分离多种电荷异构体及胶内酶切的手段用于分析N糖链结构的，克服了多种电荷异构体对N糖链结构分析的难点，能够精确分析单一电荷糖蛋白的N糖链结构，更有利于对多种电荷异构体N糖结构进行精确分析，适用于糖蛋白多种电荷异质体N糖链结构的分析与评价。

技术领域

本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域，涉及一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法。尤其涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子受体Fc（VEGFR-Fc）融合蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法。

背景技术

糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，按照连接方式的不同，可分为N-糖基化和O-糖基化，其中N糖基化是糖链与编码蛋白氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr（X为除Pro以外的氨基酸）中Asn残基上的-NH₂相连，O-糖基化是糖链与编码蛋白氨基酸序列Ser/Thr残基上的-OH相连。目前，治疗性蛋白药物大都由基因重组细胞表达，其糖基化类型及水平对药物在体内的药效、半衰期、稳定性和安全性等均有不同程度的影响。如对于单克隆抗体或融合蛋白，高甘露糖糖型和末端较低唾液酸水平，都会影响药物效应动力学（pK），导致体内的快速清除，半衰期缩短；核心岩藻糖能够降低与受体的亲和力，导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性下降；末端半乳糖主要影响补体依赖的细胞毒性（CDC）活性。

重组人VEGFR-Fc融合蛋白为同源二聚体糖蛋白，由中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达，并经高度纯化和病毒灭活步骤获得。该蛋白含有多个糖基化修饰位点，具有多种电荷异构体，糖型极其复杂，为保证各生产批次糖型的一致性，需要稳定的生产工艺和有效的糖型分析方法。为了进一步对产品进行质量研究，并对纯化过程进行精细控制，提高产品质量，本文通过等电聚焦电泳将糖蛋白多种电荷异质体分离，并对分离的异构体酶切、提取和标记糖链，结合液质联用技术对标记的糖链进行荧光质谱分析，用于指导纯化过程中目的蛋白的收集，达到获得高质量糖蛋白药物的目的。

目前，糖蛋白中糖链结构分析主要采用糖蛋白变性还原后对蛋白进行酶切处理，然后富集糖链并进行荧光标记，进一步纯化标记糖链，结合使用亲水色谱柱对各种糖链分离，进行荧光质谱分析。而本方法首先采用分辨率很高的等电聚焦电泳将多种电荷异构体分离，然后采用胶内酶切的方法将分离的糖链分别切下，再进行糖链富集和荧光标记，进一步纯化标记糖链，结合使用亲水色谱柱对各种糖链进行分离，最后进行荧光质谱分析。这有助于对多种电荷异构体分别进行糖链结构分析，有助于研究不同电荷异构体之间的糖型差异，更有利于生产工艺过程中对不同电荷异构体进行质量控制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法，该方法克服了多种电荷异构体对N糖链结构分析的难点，可以对糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构进行分析，能够精确分析单一电荷糖蛋白的N糖链结构，有助于纯化过程中目的蛋白的收集，达到获得高质量糖蛋白药物的目的。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法。包括以下步骤：（1）通过等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；（2）对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；（3）将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用糖苷酶F进行胶内酶切；（4）酶切完毕后，提取胶内酶切后的糖链，使用有机溶剂对溶液中的蛋白进行沉淀，收集上清液并干燥，富集糖链；（5）使用甲酸处理富集的糖链并进行干燥，然后对干燥的糖链使用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行荧光标记；（6）使用N糖纯化小柱对标记的糖链进行纯化，收集标记糖链；（7）对标记后的糖链进行荧光质谱分析，确认N糖链结构。

其中所述的糖蛋白是具有多个糖基化位点的糖蛋白。