[发明专利]一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法

说明书

本发明提供了一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法，载体制备方法包括以下步骤：先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散均匀，再加入3‑氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂，搅拌反应、离心，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；再加入戊二醛中反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。将上述制备得到的固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶加入到碳酸盐缓冲液中，避光搅拌反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去所述固定化壳聚糖酶载体表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法。

背景技术

壳聚糖酶是一类专一性降解壳聚糖的糖苷键水解酶。该酶反应条件温和，可以通过控制反应时间来控制水解产物，大规模生产特定分子量壳聚糖以及壳寡糖。因而在医药、食品、化工、化妆品、生物医学工程等诸多领域具有深远的应用潜力。但由于游离的壳聚糖酶的稳定性较差，而且不可回收也不能长期保存，所以极大的限制了壳聚糖酶在实际生产中的广泛应用。

随着酶固定化技术的兴起，实现了酶的更高效应用，易于底物和产物的回收、易于纯化，更在一定程度上改进了生物催化剂的性能。这一技术为壳聚糖酶的应用开拓了更为广阔的应用前景。酶的固定化材料是制备出高效生物催化剂的关键。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响。与其他固定化酶载体材料制备相比，纳米二氧化钛粒径均匀，表面具有丰富的羟基作为官能团，不仅能够大大提高载体的亲水性以及分散在水体系中的稳定性，更重要的是羟基经过活化后，能为生物大分子提供附着位点。因此，纳米二氧化钛有望成为固定化酶的优良材料。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：

S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：

先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散均匀，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂，搅拌反应、离心，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；

S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：

将步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入浓度为0.5-5%的戊二醛中反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。

其中，所述纳米二氧化钛与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比为100:1-3g/mol。

优选地，所述纳米二氧化钛与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比为100:1.5g/mol，100:2g/mol，100:2.5g/mol。

其中，所述纳米二氧化钛与所述冰乙酸的质量体积比为100:0.5-3g/L。

优选地，所述纳米二氧化钛与所述冰乙酸的质量体积比为100:1g/L，100:1.5g/L，100:2g/L，100:2.5g/L。

其中，所述氨基化修饰纳米二氧化钛与所述戊二醛的质量体积比为100:5-35g/L。

优选地，所述氨基化修饰纳米二氧化钛与所述戊二醛的质量体积比为100:10g/L，100:15g/L，100:20g/L，100:25g/L，100:30g/L。

其中，所述步骤S1中，搅拌反应的温度为45-75℃，时间为12-36h。

其中，所述步骤S2中，反应的温度为室温，时间为1-5h。