[发明专利]一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法

权利要求书

1.一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法，其特征在于：利用ATAC-seq方法测试出食药用菌在环境因子诱导前后的菌丝培养阶段的菌丝和经过环境因子诱导原基分化后原基的开放染色质区域并分析开放区域编码基因，利用RNA-seq方法测试出食药用菌在菌丝阶段的菌丝和经过原基分化后的原基的mRNA序列，并利用Venn图寻找经过ATAC-seq方法和RNA-seq方法获得的基因序列之间的共有差异基因，最终通过生物学分析在共有差异基因中寻找影响食药用菌原基分化的关键功能性基因。

2.一种如权利要求1所述的联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用。

3.如权利要求2所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于：所述绣球菌的菌丝培养阶段的菌丝取用在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝。

4.如权利要求3所述的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于，具体步骤如下：

S1、将绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝、在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基分别经过ATAC实验获得纯化DNA进行IlluminaHiSeq测序、经过RNA-seq实验获得mRNA进行Illumina HiSeq测序；

S2、经过ATAC-seq方法测序后分别获得绣球菌在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量，同时经过RNA-seq方法测序后分别获得在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导但还未出原基的菌丝对比组以及在黑暗条件下培养的菌丝和经过光照诱导后的原基对比组中表达下调和上调的基因数量；

S3、利用Venn图分析经过光照诱导但还未出原基的菌丝和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量以及共同表达上调的基因数量；同样利用Venn图分析经过光照诱导后的原基和在黑暗条件下培养的菌丝对比组中经过ATAC-seq和RNA-seq联合方法测序后共同表达下调的基因数量，共同表达上调的基因数量；

S4、综合分析经过步骤S3中获得的两对比组中共同表达下调和上调的基因数量，并利用Venn图分析寻找两对比组的共有差异基因；

S5、对共有差异基因进行生物信息学分析筛选出光照诱导绣球菌原基分化的关键功能性基因。

5.如权利要求4的一种联合ATAC-seq和RNA-seq在筛选食药用菌功能基因的方法在筛选绣球菌功能基因上的应用，其特征在于，所述ATAC实验具体操作步骤如下：

A1、样品制备：取绣球菌栽培中的黑暗条件下的菌丝、经过光照诱导但还未出原基的菌丝、经过光照诱导后的原基，用液氮速冻，超低温保存；将样品放入预先冷却含有匀浆缓冲液的匀浆器中，让冷冻的组织解冻并将组织研磨，预冷离心，取上清液，利用碘克沙醇梯度法分离细胞核，计数细胞核，每50000个细胞核核分装保存；

A2、转座反应与纯化：将50000个细胞核转移到含有1ml ATAC-RSB和0.1％Tween-20的管中，离心取上清液，加入Omni-ATAC ATAC-seq反应混合物，在37℃下孵育30min纯化DNA，用10μl elution buffer洗脱DNA；

A3、PCR扩增：取10μl经过步骤(2)转座纯化后的DNA、10μl无核酸酶的水、2.5μl浓度为25μM的PCR引物1、2.5μl浓度为25μM的PCR引物2和25μl NEB Next High-Fidelity 2×PCRMaster Mix；

A4、测序和基因数据分析进而获得不同样品表达下调和上调的基因数量。