[发明专利]一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法

说明书

本发明属于免疫学检测技术领域，涉及一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法；步骤为：水解四甲氧基硅烷，制备得到抗DON抗体溶胶凝胶、兔抗HRP抗体溶胶凝胶和空白溶胶凝胶；然后取兔抗HRP抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板一上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二，构建控制层；将筛板三置于筛板二之上；取抗DON抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板三上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四，构建检测层，得到溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱；本发明不需要复杂的前处理和大型仪器的辅助，检测时间短、灵敏度和稳定性高，满足DON污染情况调查的可视化检测需求。

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是镰刀菌属(Fusarium)的部分菌种(主要有Fusarium，Myrothecium和Stachybotrys)的一种次级代谢产物，主要污染谷物及其制品，人和动物食用污染DON的粮食和饲料后不仅可导致急慢性中毒，而且与很多疾病密切相关，因此有必要建立可靠、有效的检测方法对谷物中的DON污染进行现场监控。

目前报导的DON检测方法主要有：薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。薄层层析法这种检测方法具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点，但是检测的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差；酶联免疫吸附试验具有快速、灵敏且操作简单的优点，但由于存在所用抗体与DON的乙酰化类似物的交叉反应致使其检出值偏高，较易出现假阳性；气相色谱法(和高效液相色谱法这些方法虽然能定量分析，但其操作繁琐、不能实现现场快速检测。所以，目前还没有建立可靠、有效的检测方法对谷物中的DON污染情况进行现场监控，实现谷物中DON残留现场快速筛选技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在解决上述问题之一；本发明提供一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法；结合了免疫亲和色谱法净化、富集及ELISA显色判定结果等特点的谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶胶-凝胶(sol-gel)免疫亲和色谱柱显色快速检测方法；免疫亲和柱是在聚四氟乙烯空柱内设有两层，上层将封闭了抗DON抗体的溶胶凝胶(anti-DON sol-gel)装入构建检测层，待测样品中含有的DON可消除或减弱该层的颜色，从而根据颜色深浅达到检测样品中DON的目的；下层将兔抗辣根过氧化物酶抗体的溶胶凝胶(anti-HRP sol-gel)装入构建控制层，只要检测过程中加入酶标记物，该层都会显色；如果该层显色，则检测正常，如果该层无色，则检测失效，从而达到控制的目的。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

S1、将盐酸，蒸馏水和水解四甲氧基硅烷混合，在冰中声振，得到混合液A；

S2、先将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体加入磷酸盐缓冲液中，再加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液B；

S3、与步骤S2的操作相同，区别是使用兔抗辣根过氧化物酶抗体替代抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，得到兔抗辣根过氧化物酶抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液C；

S4、将磷酸盐缓冲液加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到空白溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液D；