[发明专利]脂肪干细胞的分离与培养方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集脂肪组织；

S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；

S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；

S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；

其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为50％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.25g/L；所述消化的时间为20min。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述消化的体系使用生理盐水作为溶剂；所述消化的环境条件如下：温度为35—38℃；转速为50—200rpm。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化的环境条件如下：温度为37℃；转速为100rpm。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述脂肪组织来自负压法抽脂术，还包括对所述脂肪组织使用生理盐水洗涤后进行机械破碎的步骤。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述富集包括离心收集沉淀的步骤，所述离心的相对离心力为400—800g，时间为5—10min。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S4中，进行所述纯化和传代培养前，包括对所述脂肪干细胞进行洗涤的步骤。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述纯化的方法为流式细胞术、免疫磁珠分选法、密度梯度离心或细胞贴壁培养法。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化的方法为细胞贴壁培养法。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞贴壁培养法和/或所述传代培养使用完全培养基进行。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加体积分数为8—20％的胎牛血清、15—100ng/ml表皮生长因子、15—100ng/ml血管内皮生长因子、和3—50ng/ml人重组白细胞介素-3。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加体积分数为8—12％的胎牛血清、15—25ng/ml表皮生长因子、15—25ng/ml血管内皮生长因子、和3—8ng/ml人重组白细胞介素-3。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加体积分数为10％的胎牛血清、20ng/ml表皮生长因子、20ng/ml血管内皮生长因子、和5ng/ml人重组白细胞介素-3。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述细胞贴壁培养法中所述脂肪干细胞的初始种植密度为0.5×10⁵个/ml—1.5×10⁵个/ml；

所述细胞贴壁培养法的培养条件为37℃、5％CO₂；

所述细胞贴壁培养法的培养时间为12—16天，培养至融合度为75—85％。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞贴壁培养法中所述脂肪干细胞的初始种植密度为1×10⁵个/ml。

16.Seq ID No.3所示的胶原酶在分离脂肪干细胞中的应用。