[发明专利]一种分析C4植物光合耐旱能力的方法

权利要求书

1.一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，通过将暗适应后的C4植物叶片，切片观察叶肉和维管束鞘细胞的叶绿素荧光并测定荧光参数；或/和将氮蓝四唑和二氨基联苯胺染色完成的C4植物叶片，切片观察叶肉和维管束鞘细胞的O₂^·-和H₂O₂组织化学定位；所述切片观察叶肉和维管束鞘细胞的叶绿素荧光并测定荧光参数，具体包括以下步骤：

步骤1.材料切片：剪取暗适应后的C4植物叶片中段部分，在叶片上垂直叶脉横切下0.4-0.6mm宽的细丝；

步骤2.叶绿素荧光显微观测：将步骤1所得的细丝以横切面放置在载玻片上，保持叶片横切面向上，放置于叶绿素荧光显微成像系统下观测叶绿素荧光，并成像保存结果数据；

步骤3.结果分析：在步骤2所得的荧光成像图中，选择3个以上完整的“花环结构”，在每个“花环结构”中的叶肉和维管束鞘细胞区域分别框选，单独分析不同类型细胞的叶绿素荧光参数。

2.根据权利要求1所述的一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，所述观测叶绿素荧光，具体为：选取40×或80×物镜下观测叶绿素荧光，选择慢速动力学模式，蓝光激发，荧光信号在695-770nm检测，测量光密度为100μmol m^-2s^-1，所述细丝须在3处以上不同位置观测，并成像保存结果数据。

3.根据权利要求1或2所述的一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述叶绿素荧光参数包括F_v/F_m、Φ_PSII、qP、NPQ中的任意一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，所述将氮蓝四唑和二氨基联苯胺染色完成的C4植物叶片，切片观察叶肉和维管束鞘细胞的O₂^·-和H₂O₂组织化学定位，具体包括以下步骤：

步骤A.取C4植物叶片中段部分，利用氮蓝四唑染色液进行叶片O₂^·-的组织化学定位染色；

步骤B.取C4植物叶片中段部分，利用二氨基联苯胺染色液进行叶片H₂O₂的组织化学定位染色；

步骤C.材料切片：分别取经步骤A、步骤B染色完成的叶片，垂直叶脉横切下0.4-0.6mm宽的细丝；

步骤D.分别将步骤C所得的氮蓝四唑染色叶片的细丝、二氨基联苯胺染色叶片的细丝以横切面放置在载玻片上，保持叶片横切面向上，放置于光学显微镜40×或80×物镜下观察细胞染色情况。

5.根据权利要求4所述的一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，所述步骤A中，叶片O₂^·-的组织化学定位染色具体为：将C4植物叶片放于氮蓝四唑染色液中，真空渗透20-40min后，室温避光反应1-3小时；倒出染色液，加入80％乙醇，沸水浴脱色至叶绿素完全去除，染色完成的叶片保存在50％甘油中。

6.根据权利要求4所述的一种分析C4植物光合耐旱能力的方法，其特征在于，所述步骤B中，叶片H₂O₂的组织化学定位染色具体为：将C4植物叶片放于二氨基联苯胺染色液中，真空渗透20-40min后，室温避光反应1天，倒出染色液，加入95％乙醇，70℃水浴脱色至叶绿素完全去除，染色完成的叶片保存在50％甘油中。