[发明专利]利用芯片合成寡核苷酸文库进行DNA洗牌文库从头合成的方法

权利要求书

1.利用芯片合成寡核苷酸文库进行DNA洗牌文库从头合成的方法，其特征在于，包括

以下步骤：

S1：选择具有特定功能的蛋白基因序列，比对这些序列，寻找同源区域，在同源区域进行交错切割，将模板基因序列双链设计成具有同源末端的寡核苷酸片段oligo，实现将全长基因序列在同源区域末端交错切割成较短的寡核苷酸文库oligo pool，再使用DNA芯片合成该oligo pool；

S2：使用固定化有错配识别蛋白MutS的纤维素凝胶柱进行oligo pool的错误移除；

S3：将错误移除的oligo文库通过基于连接酶的组装方法组装成为全长重组文库。

2.根据权利要求1所述的利用芯片合成寡核苷酸文库进行DNA洗牌文库从头合成的方法，其特征在于，所述步骤S3之后还包括步骤S4：组装反应后，以获得的组装产物为模板，通过PCR循环，进一步提高重组概率。

3.根据权利要求2所述的利用芯片合成寡核苷酸文库进行DNA洗牌文库从头合成的方法，其特征在于，所述步骤S4之后还包括步骤S5：向反应体系中加入SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示通用引物，进行PCR扩增获得大量重组的基因全长序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白为红色荧光蛋白，所述方法具体包括：

使用比对软件Bioedit对选择的21条红色荧光蛋白模板序列进行比对，根据比对结果，按照互补区域交错切割的要求设计oligo pool；向所有设计的oligo序列两端分别加入SEQID No.1和SEQ ID No.2所示通用引物，该对引物含有一个Mly I限制性内切酶酶切位点，可以通过酶切去除；以步骤S1合成的oligo pool为模板，以oligo SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示通用引物为引物，PCR反应扩增获得大量oligo，然后通过重新变性退火将合成错误的碱基展示为错配；

将重新变性退火的oligo pool上样到MICC柱子上，DNA样本在重力的作用下穿过柱体；MICC柱子是填充有固定了MutS蛋白的纤维素凝胶的色谱柱；在该过程中含有合成错误碱基的oligo被固定化在柱子中的MutS结合而滞留在柱子上，而合成正确的oligo流过柱子被收集下来；以收集的含有错误移除oligo pool的滤液为模板，通过PCR扩增获得大量的错误移除的oligo pool；

将错误移除的oligo pool通过Mly I酶切去除其两端的通用引物序列，使用UNIQ-10oligo回收试剂盒回收引物去除的oligo pool；

将错误移除的oligo pool通过基于连接和PCR的组装方法组装成为重组全长文库，然后以组装产物为模板，使用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示通用引物为引物，PCR扩增获得大量重组文库序列。