[发明专利]猕猴ABO血型基因分型方法

说明书

本发明公开了一种猕猴ABO血型基因分型方法的引物组，包括引物1，引物2，引物3，引物4，引物5，引物6，引物7，引物8。所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5，所述引物6的核苷酸序列为序列6，所述引物7的核苷酸序列为序列7，所述引物8的核苷酸序列为序列8。本发明还公开了猕猴ABO血型的基因分型方法，本发明的ABO分型技术，是在分子基因水平上的一种快速，可靠，敏感、低成本的检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及猕猴ABO血型基因分型方法。

背景技术

由于猕猴(Macaca mulatta，Macaques)与人类拥有共同祖先，他们的基因相似率大于93％，且在神经学、生理学、代谢类疾病及对微生物的敏感性方面表现的都非常相似，所以猕猴作为非人灵长类实验动物模型，被广泛用于生物医药研究中。近几年，生物医药研究领域的投入不断加大，干细胞和移植研究也得到飞速发展，而对用于这方面研究的供体和受体动物的血型要准确的掌握，ABO血型是最重要的血型系统，所以当猕猴被用于研究时就需要明确知道它的ABO血型，才能防止在移植中出现严重的排斥反应，导致实验的失败及资源的浪费。

目前应用于人ABO血型鉴定的常规技术仍是基于抗原抗体反应的血凝实验和微柱凝胶实验，但用于人血型检测的商业试剂并不适用于猕猴的血型鉴定。随着测序技术的发展， ABO血型相关的糖基转移酶基因序列都已确定，使血型研究进入分子生物学时代。事实上血型差异主要是与基因突变有关，ABO血型基因上存在丰富的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)位点，通过分子生物学方法检测ABO血型基因的SNP 位点，可以确定A，B或AB表型。目前检测SNP的方法很多，主要有Taqman PCR、普通PCR结合Sanger测序的方法、下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术等。国际上已有多篇报道 ，用多重普通PCR方法或实时定量PCR进行实验猴的ABO血型分析。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是在等位基因特异性PCR(AlleleSpecific PCR，AS-PCR)基础上，在PCR试剂中加入通用的荧光探针，通过引物3’末端碱基与SNP位点上的碱基特异互补，然后通过直接识别荧光信号来对SNP分型以及检测序列的插入和缺失，目前该技术在植物育种方面应用较多，本文首次将KASP方法应用于实验猴ABO血型检测，所选的2个SNP位点，是猕猴表达A和 B转移酶所必需的，第一个SNP位点是检测A或B表型基因区域内负责编码第266位氨基酸的突变；第二个SNP位点是检测第268位氨基酸的突变。目前尚无文献报道用KASP 方法进行实验猕猴ABO血型检测。本文建立的KASP方法相较于普通PCR方法，节省了大量的时间；相较于Taqman探针法，节约了合成探针的费用；本文同时还建立了普通PCR 结合Sanger测序法用于血型检测，适合没有实时定量PCR仪的实验室开展ABO血型分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定猕猴ABO血型方法的引物组及方法。

本发明的第一方面提供一种鉴定猕猴ABO血型的引物组，包括引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。

本发明的一优选技术方案中，所述组合物还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。

本发明的一优选技术方案中，引物1∶引物2∶引物3的摩尔比为4∶4∶5；引物4∶引物5∶引物6的摩尔比为4∶4∶5。