[发明专利]一种水中诺如病毒的检测方法

说明书

本发明公开了一种水中诺如病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；(3)配置RT‑PCR反应液；(4)荧光定量PCR仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次，荧光通道检测选择FAM、VIC通道。本发明的水中诺如病毒的检测方法，使用荧光定量PCR仪进行检测，灵敏性和准确度较高，并可定量分析。

技术领域

本发明涉及水中病毒的检测方法，特别涉及一种水中诺如病毒的检测方法。

背景技术

诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，诺如病毒基因组是单股正链RNA，基因组全长约7kb～7.5kb。诺如病毒共可分为GⅠ～GⅤ5个基因型，其中感染人的主要是GⅠ型和GⅡ型。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。

目前，国内针对水中诺如病毒的检测报道较少，诺如病毒在水中虽然比较稳定但无法增值，导致难以检测，所以，开发一种准确、稳定的检测水样品中诺如病毒的方法尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种水中诺如病毒的检测方法，该方法可以对水中的诺如病毒进行准确、定量的检测。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下的技术方案：一种水中诺如病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)水样处理与诺如病毒的富集；

(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；

(3)配置RT-PCR反应液；

(4)荧光定量PCR仪检测；

所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次；荧光通道检测选择FAM、VIC通道。

进一步地，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤为：取水样，加入MgCl₂溶液使其浓度达到0.03～0.05mol/L，调节水样使pH至3.0～5.0，使水样通过混合硝酸纤维素膜，用牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜；去除滤膜，调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入PEG8000溶液放置过夜，离心保留沉淀；加入无RNA酶的超纯水溶解沉淀，离心后上清液为病毒粗提取物。

进一步地，所述诺如病毒RNA的提取步骤为：取病毒粗提取物，加入裂解液，充分混匀，然后漂洗液漂洗数次，加入洗脱液，离心后得到纯化的病毒核酸溶液。

进一步地，所述MgCl₂溶液的浓度为2.5mol/L。

进一步地，所述牛肉膏-甘氨酸洗脱液的配置方法为：将30.0g牛肉膏和3.75g甘氨酸搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。

进一步地，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤中，洗脱液与PEG8000溶液的体积比为1:0.25。

进一步地，所述PEG8000溶液的配置方法为：将PEG8000 400.0g和氯化钠87.0g搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。

进一步地，所述病毒粗提取物加入裂解液的体积为600μL。

与现有技术相比，本发明的水中诺如病毒的检测方法的有益效果为：