[发明专利]一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用

说明书

本发明提供了一种酯酶在拆分(R,S)‑5‑己内酯中的应用，所述酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌工程菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组酯酶；该重组酯酶具有催化拆分(R,S)‑5‑己内酯的能力，可以获得(S)‑5‑己内酯，对映体过量值98％和转化率达到49.6％，拆分效率和产品收率高。

(一)技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种酯酶立体选择性催化水解拆分(R,S)-5-己内酯对映体合成单一构型的(S)-5-内酯和(R)-5-羟基己酸的应用。

(二)背景技术

(R,S)-5-己内酯主要用于杏仁、樱桃、黄油、奶油等食用香精，也用于烟草香精，可用于有机合成，为制取5-羟基己酸及其盐类的原料，是重要的香料和有机合成中间体。(S)-5-己内酯比(R)-对映体更不常见，(S)-5-己内酯可用于制备生物活性化合物如信息素，可以通过化学合成生产。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。

酯酶(EC3.1.1.1)因其能催化底物水解，合成短链酯类，因而被广泛应用在食品生产、清洁剂、化妆品、天然产物修饰等行业中。酯酶广泛存在于植物、动物、微生物中。由于微生物具有大规模工业化生产的产量高、反应稳定、操作简单等诸多优点，因而工业用酯酶大都是微生物来源。微生物酯酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的酯酶有较高的工业化应用价值。因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产重组酯酶具有十分重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性酯酶在生物法拆分(R,S)-5-己内酯中的应用，利用该酯酶可以高效拆分(R,S)-5-己内酯，得到高纯度(S)-5-己内酯和(R)-5-羟基己酸。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种酯酶在拆分(R,S)-5-己内酯中的应用(如图1所示)，所述酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示，具体的应用方法为：以含酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以(R,S)-5-己内酯为底物，以pH 7.0缓冲液为反应介质，在25-50℃、1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-5-己内酯和(R)-5-羟基己酸。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10g/L。

进一步，优选反应时间为1-5h，更优选反应条件为35℃、1000rpm反应5h。

进一步，所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性酯酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21)接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.4-0.6(优选0.5)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到酯酶粗酶粉，即湿菌体冻干粉；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值7.0。

本发明立体选择性酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：