[发明专利]幽门螺旋杆菌cagA基因失活突变株的构建方法

说明书

本申请涉及基因工程技术领域，具体公开了幽门螺旋杆菌cagA基因失活突变株的构建方法，包括如下步骤：(1)刮取生长于哥伦比亚琼脂的H.Pylori 11639菌体加入电转化缓冲液中，稀释至H.Pylori 11639菌体的浓度为10¹²个/L，获得溶液A；(2)取100μL溶液A加入冰冷的0.2cm BioRed电转杯中，并加入pHG1打靶载体50μg；(3)将电转杯放置在取液装置下方的冰块上；(4)向SOC培养基储箱中加入足量的SOC培养基，将取液管伸入电转杯；(5)将哥伦比亚血平板与筒体固定，并使涂刷与哥伦比亚血平板的表面接触，在控制器上输入启动时间为10～15min；(6)完成对哥伦比亚血平板涂刷后，取下哥伦比亚血平板。通过应用取液装置，可以减少人工操作带来的误差并提高效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及幽门螺旋杆菌cagA基因失活突变株的构建方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是胃炎、胃溃疡及胃癌发病的主要诱因之一。由H.pylori基因组中cag毒力岛(cagpathogenicity is-land，PAI)编码的CagA蛋白(Cytotoxin-associatedgene A antigen，CagA)是H.pylori的最重要的毒力因子。PAI长40kb，包含大约31个基因的多基因簇，cagA基因位于其C末端。PAI编码的Ⅳ-型分泌系统将编码的CagA注入胃上皮细胞，根据CagA蛋白编码区的不同可以将H.pylori分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型H.pylori细菌PAI岛编码CagA蛋白和Ⅳ型分泌系统，Ⅱ型H.pylori细菌PAI岛编码区不完整，不编码CagA蛋白。研究表明Ⅰ型H.pylori体外及体内毒性及致病性远高于Ⅱ型H.py-lori，因此普遍认为CagA蛋白是H.pylori最重要的毒力因子。然而，CagA蛋白的功能可能比想象的更加复杂，获得cagA基因失活的H.pylori菌株是深入研究CagA蛋白毒力、致病机理的重要的前提。目前通过同源重组基因失活方法，成功构建了幽门螺旋杆菌(H.pylori)cagA基因失活突变株，其包括如下技术步骤。

步骤(1)：H.pylori 11639菌株的培养在含有10g/L万古霉素、5g/L两性霉素B及5g/L三甲氧苄氨嘧啶的哥伦比亚血琼脂培养基中接种H.pylori 11639株菌，并置于微需氧环境中培养(10％羊血，5％O2，85％N2，10％CO2)。

步骤(2)：抗生素敏感性检测野生型H.pylori11639菌株涂布于分别含有2×10^－2g/L氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、链霉素、卡那霉素、四环素的哥伦比亚培养血平皿上，置于37℃微需氧培养，每隔24h观察幽门螺旋杆菌生长情况。

步骤(3)：pHG1 cagA基因打靶质粒构建及筛选使用pMD19-T(Takara)质粒作为H.pylori 11639 cagA基因失活质粒骨架，cagA-up-F/R引物扩增cagA基因内部500bp上游同源臂，cagA-down-F/R引物扩增cagA基因内部500bp下游同源臂；使用overlap PC R方法将上下游同源臂连接起来，并转移至pMD19-T载体上获得pHG0质粒，cat-F/R引物用于克隆位于pHK质粒上的gro-EL-cat氯霉素乙酰基转移酶表达框，将该表达框BamHI-Eco RI双酶切后连接至pHG0载体。

步骤(4)：H.pylori 11639感受态细胞制作与电转化条件刮取生长于哥伦比亚琼脂的H.Pylori 11639菌体，重悬于电转化缓冲液中(10％甘油，9％蔗糖，其余为水)，稀释至浓度为10¹²个/L。取100μL加入冰冷的0.2cm Bio Red电转杯中，加入pHG1打靶载体50μg，冰上放置10min。使用Bio Red Gene pluser调节电转参数至2.5kV，25μF，200Ω，电击一次，加入SOC培养基100μL，立即涂布至没有抗性的哥伦比亚血平板上，微需氧培养48h后转移至含2×10^－2g/L氯霉素的哥伦比亚血平皿上培养72h。