[发明专利]痰液标本中cfDNA的提取方法

说明书

本发明涉及DNA的提取方法领域，提供一种痰液标本中cfDNA的提取方法，其包括制备痰液中的cfDNA的提取样本和将提取样本使用提取cfDNA的试剂盒进行cfDNA的提取，所述痰液中cfDNA的提取样本的制备方法包括如下步骤：1)痰液收集；2)痰液标本质控；3)将痰液标本与化痰液混合，震摇至化痰完全，得到化痰混合液；4)将化痰混合液进行离心处理，分离上清液和底部沉淀，所述上清液即为无细胞上清液；5)将无细胞上清液进离心处理，收集上清液，得到提取样本。本发明的痰液标本中cfDNA的提取方法，提供了一种规范化的痰液标本中cfDNA的提取流程，能够从痰液标本中获取足量的cfDNA为后续基因改变检测提供基础。

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取方法，具体地说，涉及一种痰液标本无细胞上清中游离DNA(Cell Free DNA，cfDNA)的提取方法。

背景技术

近年来，应用靶向药物治疗非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)已经是临床肿瘤治疗中的标准治疗方法，即所谓的“精准治疗”。应用靶向药物治疗均需进行不同的基因改变检测，针对携带的不同基因改变，进行相应的药物选择。靶向药物治疗耐药患者肿瘤进展后，仍需进行基因改变检测，用于指导后续治疗，所以基因改变检测贯穿NSCLC治疗的全过程。国内及国外NSCLC诊疗指南均推荐患者常规进行一组驱动基因改变检测，包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、Her-2、C-MET等基因。

以下涉及本文中几个重要的专业术语的定义：1)驱动基因：是指对肿瘤发生及发展起到关键作用的基因，驱动基因的突变是肿瘤发展或者发展的重要原因，所谓“驱动”了正常细胞恶变的过程。在中国NSCLC患者最常见的驱动基因为EGFR基因突变；2)靶向治疗：是针对一个肿瘤驱动基因改变或者蛋白水平的改变，设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡和肿瘤发展得到控制的治疗手段；3)基因改变检测：指肿瘤患者携带的驱动基因改变检测，目的应用于临床肿瘤基因靶向治疗；4)液体活检：是指应用血液血浆、血清标本或者非血液标本(细胞学标本无细胞上清液)进行基因改变检测的技术。

传统上认为进行相关驱动基因检测所需标本为肿瘤组织或肿瘤细胞学标本。但是2/3的NSCLC发现是均为晚期，部分患者无法获得肿瘤标本完成检测，目前液体活检技术，即利用血液标本检测基因改变结果，也为临床所接受。

应用痰液标本进行基因改变检测比肿瘤组织标本、血液标本更有优势，1)获取方便、无创；2)肿瘤原位产生的分泌物，可能比血液标本的检测灵敏度更高；3)晚期NSCLC患者可出现贫血现象，痰液标本收集无需考虑贫血问题。

但是应用痰液标本中肿瘤细胞进行基因改变检测也存在问题，所以一直被业界认为是基因检测的困难标本，第一，痰标本找到癌细胞比例不高(仅占30％)，诊断灵敏度低；第二，即使查见癌细胞也几乎均为低肿瘤细胞含量标本，仅有少数痰液标本可以通过富集痰涂片中癌细胞进行基因改变检测。由此，如何建立痰液标本中cfDNA的规范化的提取流程，稳定地从痰液标本中提取获得足够量的cfDNA以保证后续基因改变检测结果的准确性，是十分必要解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明提供了一种痰液标本中cfDNA的提取方法。

本发明中涉及的各术语的定义：

基因突变检测技术：从肿瘤患者标本中检测基因改变的技术。本项目中主要涉及的基因突变检测技术为Super-突变扩增系统(Amplification Refractory MutationSystem,ARMS)技术及二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术；

化痰液：将痰液标本中粘液去除，以方便进行痰液标本中细胞的形态学观察及痰液无细胞上清中cfDNA提取的试剂配方。

本发明提供一种痰液中的cfDNA提取样本的制备方法，包括如下步骤：