[发明专利]用于检测猪圆环病毒1型和2型的实时荧光定量PCR-HRM引物

说明书

本发明涉及用于检测猪圆环病毒1型和2型的实时荧光定量PCR‑HRM引物，属于动物传染病学领域。该引物根据PCV1和PCV2基因组在5’‑端区域和复制相关蛋白（Rep）的5’‑端的前端序列区域的差异设计，该差异区是由于PCV1基因组序列相对于PCV2在该区域存在核苷酸序列缺失，导致PCV1和PCV2在该区域存在熔解温度（Tm）峰值差异，经过建立的实时荧光定量PCR方法扩增后，会出现不同的Tm峰值进行PCV1和PCV2的区分。本发明设计的引物仅需一组引物即可对PCV1和PCV2进行鉴别诊断，同时还可特异性的明确猪群中PCV1和PCV2的感染程度。本发明使用方法简单有效，成本低廉，准确性高。

技术领域

本发明涉及用于检测猪圆环病毒1型和2型的实时荧光定量PCR-HRM引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

高分辨率熔解曲线（High Resolution Melt，HRM ）是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。当使用SYBR Green I 为荧光染料时，在实时荧光PCR扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将PCR产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链DNA解链成单链DNA分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度Tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链。

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒；PCV3的有无致病力好需要更进一步深入明确。研究发现，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS），皮炎与肾病综合征(PNDS)的主要病原。

对PCV1和PCV2的基因组进行分析发现，PCV1基因组全长1759bp，PCV2全长1768 bp（或1767 bp），二者序列同源性小于80%，但PCV-1毒株间的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96%。ORF1是PCV1和PCV2最大的阅读框，位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。

当前，关于PCV1和PCV2鉴别诊断的实时荧光定量PCR方法，如实时荧光定量PCR方法（染料法和探针法）等相继报道。上述关于PCV1和PCV2的鉴别诊断均需针对PCV1和PCV2分别设计特异性的引物（或探针序列），再经过条件优化后，组装成PCV1和PCV2实时荧光定量PCR鉴别诊断方法。基于染料法的实时荧光定量PCR方法一般需要4条引物，而基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR方法也需要4条引物和2个探针序列，上述方法均费事费力，条件优化过程较为繁琐复杂，而且多个引物的多重PCR存在潜在的交叉干扰影响结果判定。本发明创造点是基于PCV1和PCV2的基因组特征设计引物，仅仅需要一组（两条）引物，建立特异性的实时荧光定量PCR-HRM方法，即可特异性的对PCV1和PCV2进行鉴别诊断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明提供用于检测猪圆环病毒1型和2型的实时荧光定量PCR-HRM引物，仅需要一组（两条）引物，建立特异性的实时荧光定量PCR-HRM方法，即可特异性的对PCV1和PCV2进行鉴别诊断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

为实现上述目的，采用以下技术方案：