[发明专利]基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用

权利要求书

1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，其特征在于，包括：反应溶液I、反应溶液II和反应溶液III；

所述反应溶液I包括：Dam甲基转移酶反应缓冲液、DpnI反应缓冲液、Dam甲基转移酶检测探针、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、DpnI、Dam甲基转移酶；

所述反应溶液II包括：末端转移酶及其反应缓冲液、dATP；

所述反应溶液III包括：dNTPs、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、哑铃状滚环模板、硫黄素T；

所述Dam甲基转移酶检测探针为具茎环结构的长度为38nt的第一DNA发夹探针，所述第一DNA发夹探针的茎部含5’-G-A-T-C-3’的回文序列，供Dam甲基转移酶特异性识别；所述检测探针3’末端使用氨基修饰；所述Dam甲基转移酶检测探针的序列如SEQ ID NO.1所示：

5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’(SEQ ID NO.1)；

所述哑铃状滚环模板由环部包含富T序列及富C序列的第二DNA发卡探针折叠成发夹结构，随后采用T4 DNA连接酶连接而成；所述第二DNA发卡探针5’端进行磷酸化修饰；所述第二DNA发卡探针长度为62nt，所述第二DNA发卡探针的序列如SEQ ID NO.2所示：

5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCTACGAAT -3’(SEQ ID NO.2)。

2.利用权利要求1所述荧光传感器检测Dam甲基转移酶的方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(a)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；

(b)向步骤(a)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II，进行末端转移酶催化的聚合反应；

(c)取步骤(b)所得聚合产物，加入反应溶液Ⅲ进行滚环扩增反应；

(d)对步骤(c)反应后的溶液进行荧光检测，实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析；

所述方法为非疾病诊断与治疗方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μM Dam甲基转移酶检测探针、96～192μM SAM、1～6U DpnI、0.1～40U/mL Dam甲基转移酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam 甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI 反应缓冲液、1μM Dam 甲基转移酶检测探针、160～192μM SAM、4～6U DpnI和0.1～40U/mL的Dam甲基转移酶。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1h。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，高温灭活处理温度为80℃，灭活时间为20min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：4～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：10～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，聚合反应条件为：37℃，40min。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，聚合反应后还包括高温灭活步骤，条件为75℃，10min。