[发明专利]一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用

权利要求书

1.一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒包含pMV261表达载体、Cpf1基因、Pj23119启动子以及NHEJ修复基因，命名为pML-Cpf1质粒；所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了Tac启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cpf1基因位于pMV261表达载体的Tac启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由Tac启动子驱动表达；所述Pj23119启动子位于pMV261表达载体的KanR抗性基因的下游；所述NHEJ修复基因位于Pj23119启动子的下游以及pMV261表达载体的复制起点(ori)的上游，由Pj23119启动子驱动表达。

2.如权利要求1所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述Cpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述DNA末端集合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述DNA连接酶LigD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求1-4任一所述的一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，编码所述Tac启动子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

6.一种可用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、crRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，命名为pJM-crRNA质粒；所述crRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列。

7.一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统，其特征在于，所述系统同时含有权利要求1-5任一所述的一种可用于基因编辑的质粒以及权利要求6所述的一种可用于基因编辑的质粒。

8.一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统。

9.如权利要求8所述的一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pML-Cpf1质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML-Cpf1质粒上的Cpf1基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的pJM-crRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM-crRNA质粒转录生成crRNA序列，crRNA序列会与Cpf1基因结合形成复合物，此复合物会靶向并切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除，需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cpf1质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成新金色分枝杆菌基因的编辑过程。

10.权利要求1-5任一所述的一种可用于基因编辑的质粒或权利要求6所述的一种可用于基因编辑的质粒或权利要求7所述的一种双质粒CRISPR/Cpf1基因编辑系统或权利要求8或9所述的一种编辑新金色分枝杆菌基因的方法在编辑新金色分枝杆菌基因方面的应用。