[发明专利]一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用

说明书

本发明提供一种具有降解虾夷扇贝类胡萝卜素功能的蛋白酶，属于基因工程技术领域。具体涉及虾夷扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因的序列和应用。本发明对基因序列进行分析，并通过RNA干扰技术验证了所述基因具有降解虾夷扇贝类胡萝卜素的功能，可用于提高虾夷扇贝闭壳肌的类胡萝卜素含量；通过在细菌表达所述基因验证了基因表达产物能够降解细菌中积累的类胡萝卜素。此外，本发明所提供的RNA干扰方法，为扇贝功能基因的研究提供了有力的工具；所提供的原核表达及蛋白纯化方法，可高效制备扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶，为从蛋白水平深入研究贝类胡萝卜素代谢机制提供了必要的实验工具。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因及其应用。

背景技术

虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)于上世纪80年代由日本引入我国，已成为中国北方重要的海水养殖贝类。普通虾夷扇贝的闭壳肌为白色，但在我国虾夷扇贝养殖群体中有的个体其闭壳肌呈橘红色。研究表明，呈橘红色的闭壳肌内积累扇贝醇酮和梳黄质两种类胡萝卜素，而在普通虾夷扇贝的白色闭壳肌中则检测不到扇贝醇酮和梳黄质。进一步的家系和多组学分析显示，闭壳肌呈橘红色为单基因决定的隐性性状，类胡萝卜素氧化裂解酶基因的表达下调是闭壳肌积累类胡萝卜素，从而呈橘红色的原因，该基因是扇贝代谢类胡萝卜素的关键基因。

类胡萝卜素是亲脂性的黄色、橙色或红色的天然色素，在自然界中广泛分布并具有结构和功能多样性。类胡萝卜素通过氧化降解产生的代谢物参与广泛的生物学过程。比如其中一种降解产物视黄醛，是11-顺式-视黄醛(视觉发色团)和全反式视黄酸等信号分子的前体。

虾夷扇贝是我国重要海产经济贝类，其主要的食物微藻中含有大量类胡萝卜素，因此制备虾夷扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶对研究贝类类胡萝卜素代谢机制有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有降解虾夷扇贝类胡萝卜素的蛋白酶，通过抑制该蛋白酶的表达可提高扇贝闭壳肌的类胡萝卜素含量，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种具有降解虾夷扇贝类胡萝卜素的蛋白酶，所述的蛋白酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶；

2)在1)的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1)中蛋白酶活性的，从虾夷扇贝中获得的蛋白酶。

编码上述蛋白酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种大肠杆菌重组菌株，所述的大肠杆菌重组菌株用于重组表达氨基酸序列为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶；

本发明再提供一种制备氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的方法，是使用上述的大肠杆菌重组菌株进行发酵制备的。

所述的方法，其步骤如下：

第一步，构建表达质粒。对虾夷扇贝类胡萝卜素氧化裂解酶基因的编码区进行扩增，将扩增得到的片段连接至pET-28a表达载体；

第二步，蛋白的原核表达：将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，添加诱导剂IPTG以诱导蛋白表达。离心收集菌体，在收集到的菌体中加入缓冲液，并使用超声破碎仪使其充分溶解。离心后分别处理上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测；

第三步，蛋白的纯化。根据SDS-PAGE检测结果，选择适当诱导条件进行大量表达，离心收集菌体。用缓冲液溶解菌体，超声破碎后，离心收集上清粗蛋白。使用Ni-NTA柱对蛋白进行纯化，对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理、制样，并进行SDS-PAGE检测。将纯度较好的组分进行透析、浓缩以及过滤，分装后于-80℃保存。本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种贝类类胡萝卜素氧化裂解酶的制备方法。