[发明专利]一种抗人B7-H4单克隆抗体及其制备和应用

权利要求书

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株为分泌抗人B7-H4单克隆抗体的BLJ杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17298，保藏日期为2019年2月18日。

2.一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述抗人B7-H4单克隆抗体为保藏编号CGMCCNo.17298的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述抗人B7-H4单克隆抗体的制备是从细菌中纯化出不含有信号肽和跨膜序列的B7-H4蛋白，用纯化的B7-H4蛋白注射Balb/C小鼠进行初次免疫：称取上述制备好的抗原，用PBS稀释，选取4-6只周龄的雌性Balb/C小鼠，弗氏完全佐剂乳化以后，加入玻璃注射器中，按照200μL/只的剂量，于小鼠腹部、腹股沟淋巴结、背部等处皮下多点注射，在首次免疫后第21天，用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，15天后，再用不完全弗氏佐剂按照首次免疫的免疫方法进行免疫，并在免疫结束一周后，采血检测，融合前2-3天进行最后一次免疫。

4.根据权利要求3所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述B7-H4蛋白的构件步骤：

(a)基因合成与亚克隆：

将不含信号肽和跨膜序列的B7-H4克隆到载体pET30a中，并在大肠杆菌中用组氨酸(His)作为蛋白表达的标签；

(b)表达量评估：

将重组质粒转染至大肠杆菌BL21 Star(DE3)中，将单个菌落接种到含有卡那霉素的LB培养基中；在37℃以200rpm摇菌培养，然后用IPTG诱导培养，用SDS-PAGE和Western blot检测其表达；

(c)放大表达量:

将存放于甘油中的BL21 Star(DE3)接种到含卡那霉素的TB培养基中，15℃培养；当吸光度OD600达到1.2时，用IPTG在15℃诱导细胞，培养16小时，离心获取细胞；

(d)纯化和分析：

用裂解缓冲液重悬细胞颗粒，然后超声处理，离心后的沉淀物用尿素溶解，离心后的变性上清液留存以备进一步纯化，将B7-H4蛋白重新折叠后用0.22μm过滤器进行过滤消毒，然后分装保存，标准BSA法测定其蛋白含量，标准SDS-PAGE法测定蛋白纯度和分子量，同时进行Western blot以验证结果，所用的凝胶为15％分离胶和5％浓缩胶；先用60V电压持续25min，再用120V电压持续1.5h；将靶蛋白胶块小心剥离，并剪出同胶块大小一致的滤纸和PVDF膜，将胶块和滤纸浸泡在转膜缓冲液中，PVDF膜浸泡在甲醇中，以滤纸-胶块-PVDF膜-滤纸的顺序放置于转膜装置，然后以24V的电压运行120min；转膜结束后，用1×PBST配制的5％牛奶室温下封闭PVDF膜，摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于摇床上10min，用抗His标签抗体为一抗室温下摇床孵育2h，用PBST洗膜4次，每次于摇床上10min，用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温下摇床孵育2h，于曝光间用ECL显色法进行曝光。

5.权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于肿瘤细胞检测的药物中应用。

6.一种权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体的生产方法，包括悬浮培养法、微载体培养法、中空纤维细胞培养系统、微囊化细胞培养系统中的任意一种。

7.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株在研究化疗耐药机制中的应用。

8.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体联合PD-L1抗体在抑制肿瘤细胞免疫逃逸中应用。