[发明专利]一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种光响应性多功能化学交联剂，结构如通式I所示：式中各个取代基定义见说明书。本发明的光响应性多功能化学交联剂制备方法简单、成本低廉，是首例基于邻硝基苄醇光交联反应的交联剂，通过光生醛基与氨基发生偶联反应来交联蛋白：在所述交联剂中，光反应基团对含‑NH₂的氨基酸残基具有很高的交联效率和选择性；通过与其它传统交联剂中所用的功能基团组合，得到具有光响应的异功能交联剂，实现异源蛋白特异性交联，在蛋白组学研究中具有重大潜在应用。

技术领域

本发明属于蛋白质及其功能研究技术领域，特别涉及一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质是基因表达的承载者，直接影响着生物的生命过程。在基因组学中，人们发现对基因的研究并不能满足对生命过程的探究需求，而研究蛋白质，则加深对生命过程的理解有重要的作用。因此，蛋白质组学在后基因时代成为重要的研究对象。近年来，用传统生物学方法对蛋白质组学进行研究，渐渐不能满足科学工作者的需求。随着化学合成工艺的成熟，人们发现化学小分子作为一种新兴的工具，是对传统生物学方法(如蛋白质印记Western Blot、酶联免疫吸附Elisa等)和生物学研究工具(如冷冻电镜)的重要补充。

对蛋白质组学的研究中，蛋白交联、修饰和标记是研究蛋白结构和相互作用的常用技术。其中，通过小分子进行蛋白质交联并利用交联质谱解析逐渐发展成为研究蛋白质结构与相互作用的重要研究方法，其优势较传统生物学方法更为直观。蛋白质交联剂是一类小分子化合物，具有2个或者更多的针对特殊基团(-NH₂、-COOH、-HS、-OH等)的反应性末端，可以和2个或者更多的蛋白质分别偶联。70年代时人们普遍使用戊二醛作为蛋白质交联剂连接抗体和指示剂(如酶类)，但其缺点是由于交联基团是随机的，容易形成杂乱的多聚体。最近，Ruedi Aebersold等使用氨基特异性的双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)这一经典的小分子交联剂，对蛋白磷酸酶家族进行交联质谱分析，成功解析了其相互作用网络(Herzog,F.,et al.(2012).Science 337(6100):1348-1352.)。这一工作堪称化学交联剂研究蛋白质相互作用的经典。随后，类似的小分子交联剂应运而生，并实现商业化，包括DSS系列物、BS3、DSSO(A.Sinz(2017).Anal Bioanal Chem 409(1):33-44.)等。这些小分子交联剂虽然可以通过引入不同反应活性基团实现异源特异性交联，但是交联过程是不可控的，在处理蛋白样品中会带来很多假阳性的结果，特别是蛋白的自交联，很大程度上限制了其对蛋白相互作用的研究与进一步的应用。

光反应由于具有时空可控性被引入小分子交联剂体系中，它可以首先利用不稳定的热反应活性基团与一种蛋白进行交联，然后通过紫外光来交联第二种蛋白，从而避免蛋白自交联的干扰，大大降低了传统化学交联带来的局限性。现有的应用到交联剂上的光响应基团主要有苯叠氮(Tanaka,Y.,et al.(2008).Mol Biosyst 4(6):473-480.)、二苯甲酮(Majmudar,C.Y.,et al.(2009).J Am Chem Soc 131(40):14240-14242.)、双吖丙叮(Suchanek,M.,et al.(2005).Nat Methods 2(4):261-267.)三种，其中很多产品也实现了商业化。但是，这种光响应交联虽然实现了时空的可控性，但是反应机理都是通过自由基C-H或N-H的插入反应，对基团没有选择性，不能明确在蛋白上的反应位点，从而丧失交联的特异性。另外，大部分光响应的交联剂虽然结构简单，但是相应衍生物的制备合成比较困难，使得其价格昂贵。

因此，寻找一种新的、易于制备的、具有特异性反应活性的光响应性基团，并将其引入小分子化学交联剂体系，就有望解决现有交联剂的缺陷。

发明内容