[发明专利]一种利用PCR-ELISA检测CSFV的方法在审
| 申请号： | 201910228897.6 | 申请日： | 2019-03-25 |
| 公开（公告）号： | CN109988868A | 公开（公告）日： | 2019-07-09 |
| 发明（设计）人： | 李鹏;王利平;刘兴友;岳锋;王选年;孙国鹏;张万方;何金娇;路欣奕;谭东鹤 | 申请（专利权）人： | 新乡学院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6804;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 453000 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 灵敏性 链霉亲和素 特异性结合 特异性引物 标记生物 高度保守 技术支撑 控制提供 凝胶电泳 序列设计 样品制备 有效结合 地高辛 灵敏度 酶标板 生物素 猪瘟 检测 试验 预防 | ||
1.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：
CSFV-F：5’-CTGCAAGGAAGATTACAGGTACGC-3’；SEQ ID NO.1；
CSFV-R：5’-TTCCACTGTGGTGGTCACACAATC-3’；SEQ ID NO.2；
所述上游引物CSFV-F5’端用地高辛标记，所述下游引物CSFV-R5’端用生物素标记。
2.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取样品RNA，反转录成cDNA，得到扩增模板；
(2)利用权利要求1所述的特异性引物，对步骤(1)获得的模板进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度；
(4)确定PCR-ELISA二抗最佳浓度；
(5)确定PCR-ELISA的临界值。
3.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的方法，其特征在于，步骤(3)所述确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度的具体步骤为：将链霉亲和素用CBS倍比稀释从1:50-1:1600，PCR产物作为一抗，1:2000HRP标记的抗地高辛抗体为二抗，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
5.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的方法，其特征在于，步骤(4)所述确定PCR-ELISA二抗最佳浓度：根据筛选出来的最佳链霉亲和素包被浓度，将HRP标记的抗地高辛抗体从1:1000依次倍比稀释到1:16000，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
6.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测CSFV的方法，其特征在于，步骤(5)所述确定PCR-ELISA的临界值：检测样品OD450值大于或者等于0.244时判定为阳性样品，小于0.244时则为阴性样品。
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