[发明专利]一种iPS细胞分化制备巨噬细胞的方法

说明书

本发明的目的在于提供一种通过iPS细胞体外培养有效分化诱导制备成熟巨噬细胞的方法。本发明提供一种将iPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞，从而从iPS获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法体系。另外，提供该EB的诱导分化方法在适于血细胞分化诱导的条件下进一步培养，能够产生各种血细胞的方法。

【技术领域】

本发明涉及一种由iPS(诱导性多潜能干细胞)分化制备巨噬细胞的方法。

【背景技术】

人类巨噬细胞(macrophage,)研究的最大障碍是人类巨噬细胞来源的有限性和异质性，目前，实验研究用人类巨噬细胞多来源于肿瘤细胞系和外周血单核细胞。前者能够无限增殖，但肿瘤来源可能导致遗传结构改变，从而造成功能缺失；后者不能自我更新，且每次试验需要大量外周血，获取困难且数量较少，来源和批次不同也会造成结果的不可重复性。如何获取大量有功能活性的巨噬细胞是研究的关键，诱导性多能干细胞(Inducedpluripotentstem cells，iPS)技术的出现为体外获得大量巨噬细胞提供了新思路。

iPS是通过体外导入特定的转录因子基因将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES)特性的多能细胞，即能够自我更新并可分化为3个胚层来源所有细胞的能力。同时，iPS避免伦理道德和免疫排斥反应等局限而备受青睐。

研究表明，iPS在适当的诱导条件下能够分化为免疫细胞。类胚体(EmbryonicBody,EB)是iPS通过悬浮细胞培养在高密度环境中形成的细胞团集合，是一种常用的ES和iPS自发分化的研究手段。在培养过程中，随着EB成熟，EB会包含三个胚层的细胞，加之方法简便易行，所以EB常用作体外定向诱导分化为如巨噬细胞等的其他谱系细胞的方法。

此外，巨噬细胞几乎涉及每一种人类疾病，其的功能可以被加强或抑制，固可改变疾病的转归；且运用iPS产生的巨噬细胞建立相关疾病模型可进一步解析巨噬细胞与疾病的关系。同时，巨噬细胞具有强大的吞噬功能，很难将外源基因导入到细胞中进行修饰，iPS的出现为解决上述问题提供了一个新方法。

【发明内容】

本发明的目的在于克服目前技术中的瓶颈，提供一种由hiPS细胞获得大量、具有免疫功能的巨噬细胞的方法。具体地说，发明提供了一种将hiPS悬浮培养成类胚体EB，再通过EB诱导的途径分化成巨噬细胞的方法体系，提高了诱导分化的效率，降低了由肿瘤细胞系分化成巨噬细胞的基因结构变异风险。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种hiPS的稳定培养方法，该方法通过提供了一种无饲养层完全培养液的培养方式，能够稳定为生成巨噬细胞提供基础细胞来源。

进一步地，hiPS培养在1％Matrigel胶包被的细胞培养皿中。

进一步地，hiPS(DYR0100，中国科学院干细胞库)培养于10μM Y27632(ROCK激酶抑制剂，Selleck公司)的hiPS无饲养层完全培养液(Pluripotent Stem Cell SFM XF/FF,中国科学院干细胞库)中。

更进一步地，hiPS在5％CO₂ 37℃细胞培养箱中培养，每天换液，3～4d传代一次，传代比例为1:4～1:6。

本发明的第二个目的是提供一种hiPS的鉴定方法，通过hiPS的细胞形态，AKP染色，RT-PCR和免疫荧光分别检测hiPS多能性基因和蛋白表达，hiPS分化能力检测方法鉴定hiPS的可靠性，从而能够为分化为提供确定hiPS。

进一步地，用倒置显微镜每天观察培养细胞的形态和形态，并拍照记录。

进一步地，对处于对数生长期和生长到汇合度达100％的hiPS进行AKP染色。