[发明专利]一种褐藻胶裂解酶Alg7D及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶Alg7D及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，对嗜糖菌属菌株2‑40(Saccharophagus degradans 2‑40)中的褐藻胶裂解酶编码基因进行了优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对所述优化的褐藻胶裂解酶编码基因进行高效分泌表达，获得褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的褐藻胶裂解酶对褐藻酸钠底物有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有0.1ml(蛋白质含量约0.03mg)彻底降解1g褐藻酸钠的能力，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于褐藻胶裂解酶制备技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶的高效制备方法及应用。

背景技术

褐藻酸是由古洛糖醛酸及甘露糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接形成的异多糖，是褐藻细胞壁的主要成分。褐藻酸及其盐类，因其具有高粘度及易形成凝胶等性能，已在食品、化工及制药等领域取得较广泛应用。然而，较高的分子量及有限的水溶性限制了褐藻酸及其盐类的应用。相对而言，其降解产物褐藻酸寡糖，因其较低的分子量及更好的生物活性，具有更广阔的应用前景。

褐藻胶裂解酶可通过β消除方式裂解褐藻酸的糖苷键，产生含有不饱和双键的褐藻酸寡糖。目前，已有大量不同来源的褐藻胶裂解酶被克隆、表达及鉴定。现有技术中褐藻胶裂解酶的制备大多是通过质粒载体转入到大肠杆菌中进行表达获得，其存在一些技术缺陷，例如，游离的质粒载体表达不稳定，经多次传代后易丢失；大肠杆菌表达的褐藻胶裂解酶Alg2A在细胞内，必须经过细胞破碎才能获得目标酶，增加了大规模制备的难度。

发明内容

本发明的目的是，提供一种褐藻胶裂解酶Alg7D的制备方法及应用；旨在提供一种经济高效的特异性褐藻胶裂解酶。为获得高效安全的褐藻胶裂解酶，对来源于嗜糖菌属细菌的褐藻胶裂解酶编码基因进行优化、全合成并在毕赤酵母中实现了分泌表达。表达的褐藻胶裂解酶具有实现褐藻酸寡糖工业制备的应用潜力。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对褐藻胶裂解酶编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的褐藻胶裂解酶。

本发明提供的一种褐藻胶裂解酶Alg7D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述褐藻胶裂解酶Alg7D的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的褐藻胶裂解酶Alg7D的制备方法为：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导培养并获得分泌表达的褐藻胶裂解酶。

所述褐藻胶裂解酶Alg7D的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于嗜糖菌属的褐藻胶裂解酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有褐藻胶裂解酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的褐藻胶裂解酶。

在对褐藻胶裂解酶Alg7D的编码基因进行优化的过程中，为了使褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中能够更大量的表达，仅选取原始褐藻胶裂解酶的羧基端催化区域(氨基酸331-611)编码基因进行优化及表达，而去除了氨基端的多糖结合区域以及5’端的信号肽序列。在进行基因表达时，是利用了毕赤酵母载体中自带的信号肽实现分泌表达。这是使得优化基因高效表达的关键技术。

利用诱导表达的褐藻胶裂解酶粗酶上清对褐藻酸钠底物进行水解并使用液相及质谱方法对产物的聚合度及组成进行分析。分析结果表明：得到的粗酶液能够实现对褐藻酸钠的完全水解。

本发明所述的褐藻胶裂解酶可单独用于褐藻酸及其盐类的降解制备褐藻酸寡糖；或者所述褐藻胶裂解酶与其他褐藻胶裂解酶混合使用，协同降解褐藻酸及其盐类。