[发明专利]一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A;Cel7A的构建方法

权利要求书

1.一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，包括以下步骤：

(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；

(2)目的基因的克隆:利用合理同源引物，合适条件，PCR扩增出Cel6A,Cel7A的基因；

(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将Cel6A,Cel7A基因插入启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体；

(4)获取重组菌株:以SalⅠ为Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,然后通过电转化转入毕赤酵母，得到Cel6A,Cel7A的重组酵母；

(5)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；

(6)重组蛋白活性检测：刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量。

2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，采用同源重组的方法构建载体，较传统方法更为简便快速，大大缩短构建周期。

3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，优化了目的基因的引物序列,合理引入6个组氨酸(His)对应的密码子，以使得表达的目的蛋白中含组氨酸，可以与镍柱结合，便于后续利用镍柱对其进行纯化。

4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A的构建方法，其特征在于，获得提取里氏木霉QM9414总RNA时，采用固体诱导培养基(表面铺玻璃纸)培养菌丝。

5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A的构建方法，其特征在于，检测重组蛋白是否具有纤维素酶降解作用时，采用刚果红-cmc的定性检测，相比DNS法更简洁迅速，误差少。

6.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，构建表达载体时,酶切插入启动子AOX1的下游，添加适量的诱导剂甲醇，提高重组毕赤酵母菌表达效率。

7.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，实现了纤维素酶蛋白Cel6A,Cel7A在毕赤酵母中的异源表达,提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率,提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。