[发明专利]一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用

说明书

发明属于生物工程技术领域，公开了一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用，所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，脂肪酶突变体由编码华根霉脂肪酶氨基酸序列序列2中的131位缬赖氨酸变为天冬酰胺而获得，其编码基因如SEQ ID NO.3所示。该突变体具有较理想耐热特性，因此特别适合工业化大规模生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种脂肪酶突变体，具体为一种脂肪酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolase，EC 3.1.1.3，)属羧基酯水解酶，是一类特殊的酯酶，能逐步地将甘油三酯水解成脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油；同时它还能催化酯的酸解、醇解、氨解以及转酯化和酯合成等反应。它以其特殊的生理生化特性被广泛地应用到生物能源、油脂加工、食品加工、皮革加工以及饲料添加等过程中。脂肪酶在生物柴油制备产业、再生能源的开发和环境保护中起着至关重要。在工业生产过程中，酶制剂往往会经历高温环境，而天然脂肪酶耐热性普遍较差，生产过程损失率高达70％—80％。天然脂肪酶在高温下失活的这一缺点，致使工业生产的成本大幅度升高，限制了脂肪酶在工业中的应用。

华根霉脂肪酶的热稳定性比较差，工业生产损失量比较大，因此生产成本也会大幅度提高。若能将华根霉脂肪酶的热稳定性提高，则其生产成本也会随之下降。因此，本发明通过对华根霉脂肪酶基因上的改造使其成为一种耐热性比较高的脂肪酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂肪酶突变体及其应用，旨在解决华根霉脂肪酶的耐热性较差和在工业生产上不理想的问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种脂肪酶突变体，该突变体由华根霉脂肪酶的氨基酸序列经取代得到，所述的华根霉脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体的，所述的脂肪酶突变体由华根霉脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第131位赖氨酸变为天冬酰胺而获得。

本发明所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的脂肪酶突变体的酶促反应最适pH值为9.0；最适温度为35℃；在pH4-pH10、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在50％，在pH7-pH10、37℃条件下，pH耐受1小时，残活还在80％以上，脂肪酶在50℃耐受75min、60℃时耐受30min残活都在50％以上。

在本发明另一方面，所述的氨基酸序列SEQ ID NO.2经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

所述的脂肪酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明另一方面，与所述的编码基因SEQ ID NO.3编码相同的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。

在本发明另一方面，本发明还包括携带有编码基因序列为SEQ ID NO.3的脂肪酶突变体的质粒。

本发明一并提供上述脂肪酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)以华根霉脂肪酶基因连接到载体上的重组质粒为模板，分别设计引物进行突变PCR扩增；

2)添加lμLDMT消化酶于PCR产物中，混匀，孵育70min；

3)加入l0μL消化产物于DMT感受态细胞中，经冰浴冷却、热激、冷却后，加500μL LB培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分上清液，悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；