[发明专利]一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用

说明书

发明属于生物工程技术领域，公开了一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木聚糖酶突变体由编码木聚糖酶氨基酸序列SEQ ID NO.2中的88位天冬酰胺变为甘氨酸(N88G)而获得。该突变体具有较理想耐热特性，因此特别适合工业化大规模生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种木聚糖酶突变体，尤其为一种热稳性提高的木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase,EC.3.2.1.8)是一类木聚糖降解酶系,属于水解酶类，主要包括:内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。木聚糖酶是饲料主要用酶之一,其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纤维素和木聚糖,主要分解产物有木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖。加木聚糖酶到饲料中，可以有效的将肠道内的木聚糖降解，改善食糜的粘度，提升饲料的利用率。

作为发展中国家，我国对饲料产量需要很大。饲料添加剂在实际应用过程中需要耐受饲料高温制粒过程，而天然木聚糖酶耐热性普遍较差，生产过程损失率高达70％-80％。那么提高他的热稳定性和催化能力就非常关键，因此，对木聚糖酶作用机理的研究以及优良性质的改造潜力巨大。本发明通过对真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因上的改造使其成为一种耐热性比较高的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种木聚糖酶突变体及其应用，旨在解决真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶的耐热性较差和在工业生产上不理想的问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种热稳性提高的木聚糖酶突变体，该突变体由真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶的氨基酸序列经取代得到，所述的真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

具体的，所述的木聚糖酶突变体由真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶氨基酸序列SEQ IDNO.3中第88位天冬酰胺变为甘氨酸而获得。

本发明所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的木聚糖酶突变体的酶促反应最适pH值为5.5；最适温度为60℃；在55℃、60℃、65℃时耐受60min残活都在50％以上。

在本发明另一方面，所述的氨基酸序列SEQ ID NO.1经修饰、缺失或添加一或几个氨基酸获得氨基酸序列，且保持只有90％的同源性的序列也在本发明的保护范围内。

所述的木聚糖酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明另一方面，与所述的编码基因SEQ ID NO.2编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列不同的核苷酸序列也在本发明的保护范围内。

在本发明另一方面，本发明还包括携带有编码基因序列为SEQ ID NO.2的木聚糖酶突变体的质粒。

本发明一并提供上述木聚糖酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)以真菌类新丽鞭毛菌木聚糖酶基因连接到载体pET-28a(+)上的重组质粒为模板，进行突变PCR扩增；

2)添加lμLDMT消化酶于PCR产物中，混匀，孵育70min；

3)加入l0μL消化产物于DMT感受态细胞中，经冰浴冷却、热激、冷却后，加500μL LB培养基，37℃180转培养1h，离心保留部分上清液，悬浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃过夜培养；

4)进行阳性克隆子筛选验证，挑取单菌落于相应抗性的LB培养基中，培养2-3h后PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子测序，测序结果与原序列比对。