[发明专利]一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法

说明书

本发明涉及一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法，该方法是利用由啶酰菌胺、氨苄青霉素和头孢噻肟组成的混合抗菌剂在莱茵衣藻培养过程中除真菌与细菌的方法。本发明的优点是利用啶酰菌胺和头孢噻肟去除真菌、氨苄青霉素去除细菌，三种有效配合使用，具有广谱性，解决利用莱茵衣藻进行实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，能够良好的保存珍稀藻种。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中的除菌方法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，简称衣藻，是一种单倍体真核细胞，具有结构简单、生长周期短、易于培养等特点，是光合作用、黑暗异养代谢、细胞调控与凋亡、细胞骨架、厌氧代谢和生物制氢、营养和能量代谢等研究领域的重要模式生物。目前，衣藻已完成全基因组测序，其相关基因的功能分析也在深入研究，基因编辑技术的发展更加推动了以衣藻为模式生物的研究，且具有实际应用价值，如纤毛疾病、生物柴油、生物去污等。然而，在衣藻的培养、研究与应用过程中会存在着杂菌污染藻种的危险，这种杂菌污染会影响实验结果，阻碍衣藻的生长，甚至会造成藻种的失活，不利于藻种的保存与应用，尤其是稀有藻种，所以找到一种有效去除杂菌又不能对藻的生长状态产生抑制作用的方法是很有必要的。

常见的除菌方法主要可分为物理法和化学法；

物理法：单克隆划线或铺板法，与离心沉淀洗脱法等。单克隆划线法或铺板法主要就是通过稀释分离的原理，使得杂菌与衣藻分离，获得没有杂菌污染的衣藻；而离心沉淀洗脱法是通过多次离心分离杂菌和衣藻。但是，这些方法都不能有效应用于杂菌污染严重的衣藻藻种，且离心沉淀洗脱法对于高粘附性的细菌也是无用的。

化学法：主要是利用抗真菌和细菌的药物来去除杂菌。如20-40μg/ml的多菌灵、甲基托布津、苯菌灵三种苯并咪唑类除真菌剂均可有效去除衣藻的真菌污染(Mahan,2005,BioTechniques)；多菌灵(40μg/ml)、氨苄青霉素(500μg/ml)、头孢噻肟(100μg/ml)可有效去除细菌和真菌的混合污染(Kan,2009,Journal of Phycology)。我们也报道了戊唑醇或者嘧菌酯，与萘啶酮酸搭配的混合抗菌剂能在一定范围能去除杂菌的污染，醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟也可以杀死混合杂菌。然而，持续使用一种或者两种组合抗菌剂去除杂菌污染，可能会造成使细菌或者真菌产生耐药性，无法彻底的去除杂菌污染。因而，多种组合的抗菌剂(除细菌+除真菌)急需探究与发现，而其中真菌的抑制最为困难(休眠的真菌孢子不容易被杀死，在条件适宜以后又开始萌发)。因此我们在已知的抗真菌剂类别中筛选了多种抗真菌剂，其中多数是对衣藻生长具有强烈抑制作用的。

细菌和真菌的生物类型、细胞结构、细胞器组成、增殖与代谢方式等均存在差异，所以除细菌、真菌需用不同的方法，通过分别选用针对细菌的抗菌剂和针对真菌的抗菌剂，再将两者相互配合使用，可有效清除细菌、真菌，具有广谱性。但是经过实践，多次使用多菌灵/氨苄青霉素/头孢噻肟，醚菌酯/氨苄青霉素/头孢噻肟，戊唑醇或者嘧菌酯/萘啶酮酸组合剂进行莱茵衣藻污染藻种的除菌后，发现杂菌不能有效的去除，从而影响莱茵衣藻的保种与后续的实验。

本发明涉及的抗真菌剂啶酰菌胺属于烟酰胺类杀真菌剂，通过抑制线粒体琥珀酸酯脱氢酶、阻碍三羧酸循环而杀除真菌，对孢子的萌发有很强的抑制能力,杀菌作用由母体活性物质直接引起，没有相应代谢活性，且与其它抗菌剂无交互抗性，杀菌谱较广。抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟均属于β-内酰胺类抗生素，均主要是通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成来有效抗细菌。氨苄青霉素对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳；而头孢噻肟对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，但对革兰氏阳性菌效果不佳，所以二者联合使用能够有效抗细菌，可有效对于多菌灵/氨苄青霉素/头孢噻肟，醚菌酯/氨苄青霉素/头孢噻肟，戊唑醇或者嘧菌酯/萘啶酮酸这些组合除菌剂无效的衣藻污染藻种的除菌。

发明内容