[发明专利]一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用

说明书

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组细胞系及其应用。所述细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和抗性筛选基因。本发明获得的稳定表达PDCoV‑N蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系，可用于检测PDCoV特异性抗体，对于未经疫苗免疫的猪群，监测到特异性抗体阳性反应即可确定该猪群已经发生野毒感染。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组细胞系及其应用。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发现的冠状病毒，可引起猪，特别是新生仔猪腹泻，其引发的临床表现与已知的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻非常相似，容易混淆，感染后可导致较高的发病率和死亡率，是近年来在多个国家和地区造成新生仔猪死亡的重要原因之一。PDCoV最早于2012年由香港学者首次发现(WooPC,et al.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in thegenus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.Journal of virology,2012,86(7):3995-4008.)，2014年在美国首次发生大规模流行(Li G,et al.Full-Length GenomeSequence of Porcine Deltacoronavirus Strain USA/IA/2014/8734.Genomeannouncements,2014,2(2)：e00278-14.)，随后在韩国，中国等地相继被检测到(Lee S,etal.Complete Genome Characterization of Korean Porcine Deltacoronavirus StrainKOR/KNU14-04/2014.Genome announcements,2014,2(6)：e01191-14.；Chen F,etal.2015.Full-length genome characterization of Chinese porcinedeltacoronavirus strain CH/SXD1/2015.Gen ome Announcements,3(5):e01284-15；)，呈现出全球流行的潜在趋势。目前对于该病毒的感染没有有效的抗病毒治疗药物和疫苗，对其疫情监控也缺乏有效的手段。核衣壳蛋白(N)是PDCoV最主要的结构蛋白之一，病毒感染后可迅速产生针对该蛋白的特异性抗体，因此建立表达N蛋白的重组细胞系可用于对猪群进行PDCoV感染抗体监测。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种PDCoVN蛋白稳定表达细胞系及其应用。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理地构建了插入PDCoVN基因的慢病毒系统表达质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N，之后将该质粒转化入Stbl2感受态细胞大量扩增，与2个辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒的包装，用收集的慢病毒感染Vero细胞，成功感染的话，慢病毒载体会将携带的PDCoV-N基因和载体上的嘌呤霉素抗性基因一起整合入Vero细胞基因组，经一定浓度的嘌呤霉素加压筛选，并通过克隆纯化获得的稳定表达PDCoV-N蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系，可用于检测PDCoV特异性抗体，对于未经疫苗免疫的猪群，监测到特异性抗体阳性反应即可确定该猪群已经发生野毒感染。

实现本发明目的的技术方案是：

一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系，其特征在于，该细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和抗性筛选基因。