[发明专利]一种产脂肽类物质的生防菌HN-2及发酵工艺

说明书

本发明涉及微生物领域，特别是一种产脂肽类物质的生防菌，为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN‑2，于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。本发明还公开了贝莱斯芽孢杆菌HN‑2的发酵工艺。通过活性测定，发现该菌株发酵液的提取物在烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）侵染烟草时对烟草有保护作用，可诱导烟草防卫反应，提高烟草对TMV的抗性，具有较高的经济效益。

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是一种产脂肽类物质的生防菌HN-2及发酵工艺。

背景技术

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）所引起的花叶病毒病是一种在全世界各烟区普遍发生、局部地区严重流行的烟草病害。烟草发病时出现叶片薄厚不匀，颜色黄绿相间，呈花叶状。后花叶斑驳程度加大，并现大面积深褐色坏死斑，中下部老叶尤甚，发病重的叶片皱缩、畸形、扭曲。当前前防治烟草花叶病毒病的方法主要是通过田间管理和栽培耐病品种。通过适当浓度的甾醇烯ME和宁南霉素AS的处理效果也可达70%以上（陈杰，2018）。目前李成军等人通过室内盆栽和大田试验进行了高温胁迫诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性效应研究（李成军、孟颢杰等，2018），使得人工诱导增强烟草对烟草花叶病毒抗性成为可能。

芽孢杆菌能产生丰富的抗菌物质，包括脂肽类、聚酮类、肽类、磷脂类和多烯类等，这些物质在防治植物病害中起着重要作用，是新型农药研究的热点。其中，最典型的是通过非核糖体途径合成的脂肽类抗生素( lipopeptides)，包括表面活性素( Surfactin) 、伊枯草菌素( Iturin) 和泛革素( Fengycin) 3 类。模式菌株枯草芽胞杆菌 B. subtilis168（B168）的全基因组序列已在 1997 年完成。该菌株具有完整的surfactin编码基因srfA、srfB、srfC和srfD等，但由于B168的sfp基因的自发突变，导致sfp基因合成的 4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶不能合成，进一步使surfactin的合成酶无法激活，导致B168菌株无法合成脂肽类物质，丧失抑菌能力。

发明内容

本发明提出一种新的贝莱斯芽孢杆菌HN-2，虽然缺失脂肽类合成关键酶基因sfp基因，但是其发酵液中仍含有表面活性素类物质，可以提高烟草对TMV的抗性。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种产脂肽类物质的生防菌，其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN-2，于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2018382。

所述的产脂肽类物质的生防菌的发酵工艺，包括以下步骤：

将所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床26-30℃，150-200r/min摇菌1-3天，即得到发酵液。

进一步，所述的发酵工艺还包括活化前处理：将以上所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2先接种于LB培养基上25-30℃活化培养1-3天；所述的LB培养基配方为（1L）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0。

一种提取以上所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液中提取物的提取方法，包括以下步骤：

取以上制得的贝莱斯芽孢杆菌HN-2的发酵液，发酵液离心去除菌体，保留上清液即无菌体发酵液；无菌体发酵液加入正丁醇萃取，取上层正丁醇层，去除正丁醇，干燥，即得。

进一步，发酵液离心条件为：10000转每分钟离心10分钟；无菌体发酵液与加入的正丁醇的体积比为1:1；所述的干燥方法为冷冻干燥。