[发明专利]一种异源从头生物合成丹酚酸B的方法

说明书

本发明涉及一种在酿酒酵母中引入外源功能基因构建的经由迷迭香酸从头生物合成丹酚酸B的方法，属于生物技术领域。采用外源基因与宿主菌株内源酶相结合的方法，构建了不需要添加苯丙素类化合物底物、以基本碳源和氮源为原料从头生物合成丹酚酸B的重组酿酒酵母菌株，开创了首例异源从头生物合成丹酚酸B的方法，为药用丹酚酸类化合物工业化生产奠定基础。

技术领域

本发明主要涉及一种从头生物合成丹酚酸B的方法，具体说，利用外源从头合成迷迭香酸的生物合成途径，与绿色微生物酿酒酵母W303a株系中内源酶共同催化作用下，通过发酵工艺，使工程菌株以基本碳源和氮源为原料，从头合成迷迭香酸与丹酚酸B的方法，属于生物技术领域。

发明背景

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一味传统中药，现多以注射剂型用于临床治疗心血管疾病，其他潜在的药理活性和应用仍在研究中，如抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗类风湿和抗老年性痴呆。脂溶性二萜类(丹参酮)和水溶性酚酸类(丹酚酸)是丹参中主要的具有药理活性的成分。目前已确认结构的丹参酮约有30余种，包括甲基丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA(TA-IIA)等，其中TA-IIA被认为是具有显著药理活性的具有代表性的化合物。丹酚酸包含丹参素(又称丹酚酸A，SAA)、丹酚酸B、C、D、E、K和L等20余种苯丙素类化合物，其中丹酚酸B(SAB)是丹参的主要活性成分且化学性质相对稳定。

2006年丹参多酚酸盐注射液正式成为临床用药，其主要药理活性成分是SAB，迷迭香酸(RA)是SAB前体化合物，有关RA在植物中的生物合成途径已基本阐明，RA至SAB的代谢通路尚未完全明了。文献报道，漆酶(laccase)可能参与了RA到SAB的生物合成。当前，丹参的根部是获取SAB的唯一来源。研究表明，我国各地栽培的丹参中其根部SAB含量在37.34mg/g～68.37mg/g之间。目前，大量研究表明可以通过生物或非生物的手段提高丹参中SAB的含量，甚至已有研究表明可成功通过微生物发酵生物合成一些迷迭香酸生物合成途径的中间产物及一些具有药理活性的衍生物。

在安全性较高的酿酒酵母菌株中构建从头合成RA的完整生物代谢通路，利用酵母底盘细胞内源酶与外源生物合成途径相结合，不仅对解决RA、SAB的资源问题具有重要意义，也提出一种新的高价值天然产物的异源合成途径优化思路。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于运用生物技术方法，克隆外源更高活性的关键酶基因替换酿酒酵母工程菌株YW-S4C2FG表达载体上的途径基因，获得新的重组酵母菌株YW-S3C3FG。该重组酵母菌在外源生物合成途径与酿酒酵母内源酶共同催化作用下，以基本碳源和氮源为原料，从头合成RA和SAB。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种异源从头生物合成SAB及RA的重组酵母工程菌YW-S3C3FG，其特征在于：对工程菌株YW-S4C2FG的途径基因进行组合优化，重组工程菌宿主菌株的优化，重组菌株发酵条件(温度及pH)的探索，发酵培养基中碳源与氮源的种类对重组酵母菌株生长曲线的影响，针对重组酵母菌株发酵中各中间产物的LC-MS定量方法的探究，及发酵罐中高密度发酵工艺流程的建立。

所述工程菌株YW-S4C2FG为同时含有丹参来源的酪氨酸转氨酶(TAT)、4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)、对羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)、迷迭香酸合成酶(RAS)，彩叶草(Coleusblumei)来源的细胞色素P450酶(CYP)、细胞色素P450还原酶(CRP)，约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸解氨酶(TAL)和大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)来源的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG)的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)YW-S4C2FG(专利申请号201810369553.2)；

本发明所述的一种异源从头生物合成SAB及RA的重组酵母工程菌YW-S3C3FG，其特征在于，包括如下具体步骤：