[发明专利]一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法

说明书

本发明公开了一种增加酶催化制备α‑酮戊二酸转化率的方法，包括以下步骤：在酶催化L‑谷氨酸或L‑谷氨酸盐制备α‑酮戊二酸的过程中，监测丁二酸的含量，通过流加过氧化氢酶，控制丁二酸的含量不超过0.1‑1.0g/L。采用本发明的方法可以提高L‑谷氨酸(钠)的转化率至99‑100％，减少副产物的生成，有利于α‑酮戊二酸的分离纯化。通过分批添加底物，产物浓度最高达130g/L以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法。

背景技术

α-酮戊二酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品领域。市场上应用作为广泛的是作为功能性运动型饮料或食品的原料，如精酮、鸟酮(1:1或2:1)等。

α-酮戊二酸的主要生产方法包括：化学合成法、微生物发酵法和生物酶催化法。其中，化学合成法涉及到有害试剂，对生态环境有较为负面的影响，目前α-酮戊二酸的合成已经很少使用化学合成法。微生物发酵法生产α-酮戊二酸，具有制备条件温和、环境友好等优势，但缺点是生产周期较长、产物浓度较低、副产物多、分离纯化困难、生产成本高等。如CN101717735中改造了丙酮酸工业生产菌株，将代谢流导向TCA循环，过量积累α-酮戊二酸，最终产物浓度为31.7g/L，仍处于较低水平，没有工业化生产价值。CN102676438A中构建了一株大肠杆菌基因工程菌，48h发酵α-酮戊二酸含量达90g/L，但其纯度仅为95％，杂酸较多，不利于分离纯化。

酶催化制备α-酮戊二酸，具有反应条件温和，控制简单，周期短，产率高，环保压力小等优势。而在酶催化法中，一般使用L-谷氨酸氧化酶，有是否串联表达过氧化氢酶的基因工程菌之分；近年也有L-谷氨酸脱氢酶的报道，如CN106834366A中使用L-谷氨酸脱氢酶制备α-酮戊二酸，但该酶需要额外添加辅因子(NAD或NADP)导致成本较高，不利于工业化生产。串联表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的优势是减少了外源添加的原料成本，简化了转化工艺，缺点是由于过氧化氢酶的稳定性本身也受到过氧化氢的负面影响，不利于α-酮戊二酸的大量积累。如CN106047913A中串联表达双酶，最大产物浓度127.1g/L，但转化率仅为96.9％，其平均转化率仅在95％左右，转化率较低意味这副产物多，不利于分离纯化。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法。采用本发明的方法，α-酮戊二酸的转化率可达99-100％，同时可以达到较高的产物积累，最高可达130g/L以上。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种增加酶催化制备α-酮戊二酸转化率的方法，包括以下步骤：

在酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸的过程中，监测丁二酸的含量，通过流加过氧化氢酶，控制丁二酸的含量为0.1-1.0g/L。

由于反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，需要对反应体系中的丁二酸的含量进行控制，以保证α-酮戊二酸的转化率。经试验发现，将体系中的丁二酸含量控制在0.1-1.0g/L，α-酮戊二酸的转化率较高。若丁二酸的含量高于1.0g/L，说明过氧化氢的残留较高，不仅对酶活产生不利影响，而且也不利于α-酮戊二酸的稳定性；若过量添加过氧化氢酶将丁二酸的含量控制在更低水平(如0.1g/L以下)，则过量的过氧化氢酶会抑制L-谷氨酸氧化酶的活性，导致α-酮戊二酸的转化率降低。

优选的，所述酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸具体为：

以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为底物，加入一水合硫酸锰和过氧化氢酶，调节pH至6.5，再加入L-谷氨酸氧化酶，转化反应14-20h。

本发明在酶催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐制备α-酮戊二酸的过程中，加入一水合硫酸锰可以作为酶的激活剂，有效提高了过氧化氢酶和L-谷氨酸氧化酶的酶活力。