[发明专利]一种双sgRNA位点敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统与应用

权利要求书

1.一种敲除INS基因的sgRNA，其特征在于，包括INS sgRNA-1和INS sgRNA-2；

所述INS sgRNA-1的序列如下：

INS sgRNA-1：CCACCAGGTGTGAGCCGCAC；

INS sgRNA-1 oligo1：5’-caccgCCACCAGGTGTGAGCCGCAC-3’；

INS sgRNA-1 oligo2：5’-aaacGGAGGGGAACTTCCTACACCc-3’；

所述INS sgRNA-2的序列如下：

INS sgRNA-2：TACCTAGTGTGCGGGGAACG；

INS sgRNA-2 oligo1：5’-caccgTACCTAGTGTGCGGGGAACG-3’；

INS sgRNA-2 oligo2：5’-aaacCGTTCCCCGCACACTAGGTAc-3’。

2.一种双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括权利要求1所述INS sgRNA-1和INS sgRNA-2的DNA序列。

3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPR V2，得到酶切后的载体；

步骤2，将所述靶向敲除INS基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接，得到得到靶向敲除INS基因的LentiCRISPR V2-INS sgRNA-1&LentiCRISPRV2-INS sgRNA-2，构建靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统。

4.如权利要求2或3所述靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除INS基因的细胞株中的应用。

5.一种敲除INS基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是运用权利要求2所述双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的INS基因缺失的细胞株。

6.如权利要求5所述的敲除INS基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株为A549细胞株。

7.如权利要求5所述的敲除INS基因的细胞株，其特征在于，所述INS基因的具体靶向敲除位点为：

CACCCTCTGATGTATCTCGGGGCTGCCGAAGCCAACACCGTCCTCAGGCTGAGATTCTGACTGGGCCACAGGGAGCTGGTCACTTTTAGGACGTGACCAAGAGAACTTCTTTTTAAAAAAGTGCACCTGACCCCCTGCTGGGTGGCAGCCTCCTGCCCCCTTCTGCCCATGCTGGGTGGGAGCGCCAGGAGCAGGGGGTGGCTGGGGGCGGCCAGGGGCAGCAATGGGCAGTTGGCTCACCCTGCAGGTCCTCTGCCTCCCGGCGGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAGCCTGTG------------------------------------------ACGAGGTGTTGGTTCACAAAGGCTGCGGCTGGGTCAGGTCCCCAGAGGGCCAGCAGCGCCAGCAGGGGCAGGAGGCGCATCCACAGGGCCATGGCAGAAGGACAGTGATCTGGGAGACAGGCAGGGCTGAGGCAGGCTGAAGGCCAGGTGCCCTGCCTTGGGGCCCCTGGGCTCACCCCCACATGCTTCACGAGCCCAGCCACGTCCTCCCTGCTGCAGAGCTGGGGCCTGGGGTCCAGCCACCCTGGAATCCTGAGCCCACCTGACGCAAAGGCCCTTGGAACAGACCTGCTTGATGGC。