[发明专利]调控Bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸及其应用

说明书

本发明公开了一种调控Bcl‑x基因选择性剪接的反义寡核苷酸及其应用，所述核苷酸包含如下序列：5′‑GCT TGG TTC TTA CCC AGC CGC CGT T‑3′（SEQ ID NO.1），所述调控Bcl‑x基因选择性剪接的反义寡核苷酸可以用于制备治疗慢性粒细胞白血病或伴Bcl‑x剪接异常肿瘤的药物，尤其用于慢性粒细胞白血病的化疗增敏、阻止慢性粒细胞白血病进展或抑制耐药。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种反义寡核苷酸，具体涉及一种调控Bcl-x基因选择性剪接的反义寡核苷酸以及其在制备用于慢性粒细胞白血病化疗增敏、阻止慢性粒细胞白血病进展和抑制耐药的药物和制备用于治疗伴Bcl-x剪接异常肿瘤药物中的应用。

背景技术

选择性剪接(alternative splicing)是指一个信使核糖核酸(mRNA)前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体，使最终的蛋白产物会表现出不同或者相互拮抗的功能和结构特性。Bcl-x是Bcl-2家族成员之一，其通过选择性剪接主要生成两种剪接异构体，Bcl-xL和Bcl-xS，Bcl-xL是重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-xS则是重要的促凋亡蛋白，两者生物功能相互拮抗，表达处于平衡状态，当Bcl-x基因的剪接发生异常时，Bcl-xL/Bcl-xS比值显著上调，现已证实这是乳腺癌等肿瘤发生、发展的关键分子事件，同时也是肺癌等肿瘤出现化疗抵抗的重要分子基础。如今，慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)作为起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病也面临着化疗抵抗及耐药的问题，靶向BCR-ABL的第一、二代酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)的化疗耐药已成为其治疗的最主要障碍，尤其是加速期和急变期CML对化疗药物的抵抗更加严重，患者预后极差，应用TKIs或其它化疗药物治疗均无法取得长期疗效。本发明申请人前期研究发现，CML中Bcl-x基因发生异常剪接大量转录生成Bcl-xL，而Bcl-xS相应减低，致 Bcl-xL/Bcl-xS比值显著增高，应用第一代TKIs伊马替尼(imatinib，IM)能纠正CML细胞中该异常剪接事件，并且Bcl-xS表达增加是imatinib诱导CML细胞凋亡的重要机制之一。

早在19世纪70年代，反义核苷酸(AON)的概念就被学者提出，它是指一段与靶基因mRNA互补的一段单链DNA或RNA序列，通常由十几到几十个碱基组成，通过碱基互补原理，干扰基因的复制、转录、mRNA的剪接加工、输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长分化等。迄今，反义核苷酸类药物成为科学研究的一个热点，也为抗病毒及抗肿瘤治疗提供了新的思路。然而，它也存在着天然的弊端。以第三代反义核苷酸—吗啉反义寡核苷酸(antisense morpholino oligomer,AMO)为例，其最大的缺陷在于特殊的分子结构导致其不带有任何电荷，使得AMO无法被细胞表面的任何受体所识别，同时无法通过转染的方式导入到细胞内。因此只有通过物理损伤细胞膜的方式才能将AMO分子导入细胞，这个缺陷极大限制了AMO的应用。为此，Gene Tools公司开发出了一种特定的传送载体，称之为“三嗪八胍结构树”，该载体的核心为一个三嗪核，三嗪核共有三个N-末端，相对的两个N-末端分别结合四个胍头结构，第三个N-末端则和AMO共轭结合。该载体内的八个胍头结构能通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带AMO穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。这种载体与AMO共轭结合形成一个具有转运功能且具有生物学效应的整体，即 Vivo-Morpholino反义寡核苷酸(Vivo-Morpholino Antisense Oligomer，vMO)(参见US patent No.7935816及图2)：。