[发明专利]一种双sgRNA位点敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统与应用有效
申请号: | 201910242220.8 | 申请日: | 2019-03-28 |
公开(公告)号: | CN109897854B | 公开(公告)日: | 2020-12-25 |
发明(设计)人: | 赵恩峰;贺小宏;王延宾;任江涛;韩露 | 申请(专利权)人: | 江苏浦珠生物医药科技有限公司 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/90;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/6851 |
代理公司: | 南京众联专利代理有限公司 32206 | 代理人: | 卢倩 |
地址: | 211500 江苏省南京市江北新区新锦湖*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 sgrna 位点敲 zyg11a 基因 crispr cas9 系统 应用 | ||
1.一种敲除ZYG11A基因的sgRNA,其特征在于,包括ZYG11A sgRNA-1和ZYG11A sgRNA-2;
所述ZYG11A sgRNA-1的靶序列如下:
ZYG11A sgRNA-1:GGTTAGCAATCAGGACATTC;
所述ZYG11A sgRNA-2的靶序列如下:
ZYG11A sgRNA-2:GGAAACTCCAATGCTCCGGA。
2.一种双sgRNA位点靶向敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,包括权利要求1所述ZYG11A sgRNA-1和ZYG11A sgRNA-2的DNA序列。
3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,用包括以下步骤的方法构建所述CRISPR/Cas9系统:
步骤1,使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPR V2,得到酶切后的载体;
步骤2 ,将所述靶向敲除ZYG11A基因的sgRNA的DNA 序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR V2载体连接,得到靶向敲除ZYG11A基因的LentiCRISPR V2-ZYG11A sgRNA-1LentiCRISPR V2-ZYG11A sgRNA-2,构建靶向敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统。
4.如权利要求2或3所述靶向敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除ZYG11A基因的细胞株中的应用。
5.一种敲除ZYG11A基因的细胞株,其特征在于,所述细胞株是运用权利要求2所述双sgRNA位点靶向敲除ZYG11A基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的ZYG11A基因缺失的细胞株。
6.如权利要求5所述的敲除ZYG11A基因的细胞株,其特征在于,所述细胞株为A549细胞株。
7.如权利要求5所述的敲除ZYG11A基因的细胞株,其特征在于,所述ZYG11A基因的具体靶向敲除位点为:
CATCAAGTGGAATAGGTATGGCATGACCAGTTTTATGTTGAATTGTTGCAGATGTATTCTAACAAAGTTTGTTTGGGGTTTTGTTTGCTAGGAAGAGGCATCTCCCTACACTTTGGTCAACATCTGCCTGAA-------------------------------------------GGAGCATTGGAGTTTCCCTCAGGAAGTAGCCGAGCGATTTCTCAGGGTGATGACTTGGCAAGGTAGTGATAAGGCTTCTCTAAAGTCAGCTCTTGCAGTACTTTACTATTTGAAAAGCACTTTTACACACAATTTCTATTGTGATTCTCACAAAGTATTTCCATTTCATTTGTCTGGAAGTTGAGACTCACTCTTTCTGGGATTCCATGATGGAAATTGTCTTCTAGGCTAGCCCTGCTATTGACTTGGT。
8.如权利要求5所述的敲除ZYG11A基因的细胞株的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将含有sgRNA的质粒转染至细胞株,得到敲除ZYG11A基因的细胞株。
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