[发明专利]一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法

权利要求书

1.一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、细胞胞体培养：将脐带剪成小段并放入含2%双抗的PBS洗液中洗涤2～3次，之后放入培养皿中并剪碎至糊状，加入培养基并搅拌均匀，之后移入培养瓶中并加入培养基，将培养瓶放入CO₂培养箱，5～9天后往培养瓶中加入培养基，之后在显微镜下观察到培养瓶局部出现细胞融合度达到90%以上时，用胰酶消化传代并收集；

b、将分离得到的间充质干细胞进行鉴定：对胰酶消化后的细胞使用细胞染色缓冲液或PBS洗涤液进行洗涤，之后1000～2000rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加染色缓冲液制成细胞悬液,将细胞悬液加入流式细胞管中备用，之后对细胞悬液进行封闭Fc受体，并对细胞悬液中加入荧光标记的抗体，混匀后置于冰上，避光孵育30～40min，加入FACs 缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，1000～2000 rpm离心细胞悬液5～10min，弃掉上清液后加入FACs 缓冲液或PBS洗涤液重悬细胞，之后用流式细胞仪碱性检测和分析；

c、复苏扩增细胞：将细胞冻存后取出放入37℃水浴锅中，使其全部融化，在放有培养基的离心管内放入解冻的细胞悬液，之后1000～2000rpm离心5～10min并倒去上清液，向离心管中加入培养基吹打均匀，离心洗涤并倒去上清液，加入培养基重悬细胞，转移至培养瓶后放入CO₂培养箱培养24～48h，之后吸出培养基加入PBS洗涤液进行洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入培养基重悬、离心洗涤，倒去上清液，加入培养基重悬，转移至培养瓶后放入CO₂培养箱培养；

d、收集清洗细胞体用于细胞胞内活性肽的提取：观察到培养瓶内的细胞融合度达到85～90%后吸出培养基，加入PBS洗涤液洗涤，洗涤完成后吸出洗涤液并加入胰酶，直至肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落后加入培养基终止消化，吹打细胞层并吸取细胞悬液于离心管内1000～2000rpm离心5～10min，倒去上清液，再加入PBS洗涤液重悬、离心洗涤收集细胞；

e、液氮反复冻融法破碎细胞收集细胞胞内活性肽：将收集的细胞进行繁殖培养，收集培养到P10代且呈细小梭型的细胞，胰酶消化后离心收集细胞体后三次梯度离心洗涤收集沉淀物，沉淀物加去离子水，依次进行液氮反复冻融法和低速离心，离心后取上清液进行离心超滤，将超滤后的滤液进行固相萃取，洗脱液由甲醇、水以及甲酸混合组成，得到的洗脱液用氮气吹挥发干净甲醇得到细胞胞内活性肽液；

f、采用真空冷冻干燥机对细胞胞内活性肽液进行冻干浓缩得到活性肽冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于：在步骤a中，洗涤后的脐带在放入培养皿之前，将脐带挑去血管组织。

3.根据权利要求1所述的一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于：在步骤c中，冻存的细胞在水浴时需在1min内全部融化。

4.根据权利要求1所述的一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于：在步骤c和d中，终止消化时，加入的培养基均大于所用胰酶一倍体积。

5.根据权利要求1所述的一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于：在步骤e中，三次梯度离心洗涤的具体操作是第一次离心在3000～5000rpm下离心15min，去上清，然后收集沉淀物，吹散，加入PBS洗涤液到50毫升，混匀继续进行第二次离心，在3000～5000rpm下离心10min，去上清，然后收集沉淀物，吹散，加入PBS洗涤液到50毫升，混匀继续进行第三次离心，在3000～5000rpm下离心5min，去上清，收集沉淀物，其中第一次离心、第二次离心、第三次离心的转速一致。

6.根据权利要求1所述的一种细胞胞体来源胞内功能生理活性肽库的构建方法，其特征在于：在步骤e中，沉淀物加去离子水配置成细胞浓度为8*10⁵个/ml的细胞浓度。