[发明专利]PCR引物及其在DNA片段连接中的应用

说明书

本发明提出了一种PCR引物及其在DNA片段连接中的应用。所述PCR引物包含回文序列段和任意PCR引物序列段，所述回文序列段的3’端与所述任意PCR引物序列段的5’端相连，所述回文序列段的3’端的核苷酸为U，所述任意PCR引物序列段与预扩增DNA模板的3’端互补配对。根据本发明实施例的引物可用于测序文库的构建，在构建过程中，利用根据本发明实施例的引物作为基于DNA的PCR扩增引物，所获得的扩增产物DNA双链的两端具有回文序列结构，且回文序列结构的3’端具有核苷酸U，为后续不同扩增产物双链DNA的相互连接奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及PCR引物及其在DNA片段连接中的应用，更具体地，本发明涉及PCR引物、PCR扩增方法、构建测序文库的方法以及全长转录组的测序方法。

背景技术

基因组和转录组测序是生命科学领域的基础性工作。由于绝大部分非模式生物缺乏基因组数据，全长转录组测序就变得尤为重要，全长转录本可以大大促进这些物种的基因功能、基因表达调控和进化关系等多方面的基础与应用研究。当前，绝大多数的转录组数据都是基于第二代高通量测序技术获得的。然而，第二代测序技术测序序列短，短序列拼接无法提供大量的长转录本并且丢失了可变剪接等重要信息，因而转录组的从头测序开始采用PacBio第三代测序技术。在2013年PacBio RS II推出时，其通亮较低，测序成本一直让科研人员望而止步。到2015年10月，PacBio推出Sequel平台，大幅提升了全长转录组的测序通量，在通量上是PacBio RSⅡ的5-10倍。鉴于三代测序技术在科研甚至临床领域的发展潜力，很多公司相继引入Sequel平台，提供Pacbio三代测序的全长转录组测序服务。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

通常转录本的平均长度低于2k，常规建库所得到的转录组文库平均长度也同样低于2k，而Pacbio测序平台的酶读长可达到20k以上，即转录组文库平均的测序轮数达到10轮以上。根据统计，测序轮数达到3轮，测序的QV值即可达到0.9，已足够对转录组进行准确的分析。所以多出来的7轮测序可认为是数据冗余，即现有的全长转录组建库方式无法充分利用Pacbio平台酶读长的优势。而近期Pacbio公司推出了试剂和芯片的升级，升级后的酶读长可达到80k以上，若仍用现有的建库方法，转录组测序将产生更大的数据冗余。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种PCR引物。根据本发明的实施例，所述PCR引物包含回文序列段和任意PCR引物序列段，所述回文序列段的3’端与所述任意PCR引物序列段的5’端相连，所述回文序列段的3’端的核苷酸为U，所述任意PCR引物序列段与预扩增DNA模板的3’端互补配对。根据本发明实施例的引物可用于测序文库的构建，在构建过程中，利用根据本发明实施例的引物作为基于DNA的PCR扩增引物，所获得的扩增产物DNA双链的两端具有回文序列结构，且回文序列结构的3’端具有核苷酸U，为后续不同扩增产物双链DNA的相互连接奠定了基础。

根据本发明的实施例，上述引物还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述回文序列段的长度不受特别限制，只要能够满足后续不同扩增产物双链DNA相互之间的粘性末端连接即可。根据本发明的具体实施例，所述回文序列段的长度为2bp，4bp，6bp，8bp，10bp或12bp。

根据本发明的实施例，所述回文序列段具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列。

ACTAGU(SEQ ID NO:1)。

ACTCAUGAGU(SEQ ID NO:2)。