[发明专利]一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法

权利要求书

1.一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于：所述方法包含如下步骤：

1)基因序列的获取：利用PCR技术在引物1、引物2的作用下，以铜绿假单胞菌PAO1中的基因组DNA为模板，扩增得到约0.6kb的鸟苷酸环化酶的基因片段；将该片段连接到pET-32a载体上，获得克隆载体pET-PA0847；

2)突变重组载体的构建：根据野生型0847基因的氨基酸序列，选择突变位点，设计点突变表达引物，以步骤1)中的重组质粒pET-PA0847为模板，通过PCR扩增得到了突变的鸟苷酸环化酶基因；突变鸟苷酸环化酶基因克隆于表达载体pET-32a，构建了含有0847点突变鸟苷酸环化酶基的表达重组载体pET-PA0847-I；

3)酶切：对上述载体进行转化并提取质粒，提取出的质粒使用双酶切进行验证，使用的限制性核酸内切酶为BamHI及HindIII，进行酶切操作，琼脂糖凝胶电泳；

4)转化：将表达重组质粒pET-0847及pET-PA0847-I转化至大肠杆菌中，获得含有表达重组质粒pET0847及pET0847-I的重组大肠杆菌BL21菌株BL21-0847及BL21-0847-I；

5)诱导表达：将经验证后的含有重组质粒的转化大肠杆菌BL21菌株BL21-0847及BL21-0847-I，用含有100μg/ml氨苄霉素的LB培养液，培养到菌体浓度OD600为0.5-1.5，收集含有重组鸟苷酸环化酶的菌体细胞；

6)破菌收集蛋白：对获得的含有表达重组蛋白的大肠杆菌菌体超声波破碎，超声波破碎后离心4℃、8000rpm离心10min；

7)蛋白纯化：对诱导后的菌液经收菌、重悬、超声破碎、分离上清与沉淀、纯化上清等操作，以获得纯化后的体外蛋白；

收菌：将诱导后的细菌于6000rpm，4℃，15min，收集菌液；

重悬：将收集后的菌液使用缓冲液进行重悬，其中缓冲液Tris-NaCl的组成为：Tris-0.02M，NaCl-0.1M，pH＝7.6；

超声破碎：使用超声破碎仪在强度50，最高温度37℃，5s-3s间隔，时间15min的条件下，超声两次，以彻底破碎细菌；

分离上清与沉淀：将破碎后的菌液于12000rpm，4℃，30min，分离上清与沉淀；上清置于4℃冷藏并尽快纯化；纯化上清：将含目的蛋白的上清进行Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化操作，所需试剂：

Binding buffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,10mM咪唑，pH8.0

Washing buffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,20mM咪唑，pH8.0

Elution buffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,250mM咪唑，pH8.0；

8)蛋白透析：对纯化收集的目的蛋白溶液，于透析袋中透析，所述透析袋的分子量为8000～14000；所述透析液为：20mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，加水至1000mL，置于4℃的冰箱中，磁力搅拌器透析过夜；

9)采用BCA法测定蛋白浓度；

10)收集透析后的蛋白溶液，进行蛋白体外催化反应。

2.根据权利要求1所述的一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于：所述步骤1)中的引物1，其序列为：PA0847Gexpfor:5’—agaggatcccagatcgcctaccagcagcaattg—3’。

3.根据权利要求1所述的一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于：所述步骤1)中的引物2，其序列为：PA0847Gexprev:5’—tagcaagctttcaggctggcgcctggtacagg—3’。

4.根据权利要求1所述的一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法，其特征在于：所述步骤3)中的酶切体系为20ul酶切体系，具体为：

内切酶1ul+内切酶1μL

10×buffer 2μL

质粒DNA 8μL

ddH2O 7.5μL

BSA 0.5μL。