[发明专利]一种藏红花来源的CCD2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种藏红花来源的CCD2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株。本发明所述CCD2突变体具有V120F、Y190K/A、R192V/F、E211A、E212A、T290V、K320A和S323F/A/T位点突变中的一种或两种以上。本发明针对藏红花酸合成路径中的限速酶CCD2进行改造，通过拓宽CCD2的底物谱，实现从β‑胡萝卜素直接合成藏红花酸，对现有的藏红花酸合成路径精简重构，从而解决多步反应总产率普遍低的问题；同时提高CCD2催化原底物玉米黄质合成藏红花酸的效率，进而获得一株高产藏红花酸的酵母菌株。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种藏红花来源的CCD2突变体及其编码序列和应用以及生产藏红花酸的重组酵母菌株。

背景技术

藏红花酸(Crocetin)，又名西红花酸或番红花酸，是西红花提取物的有效成分之一，分子式为C₂₀H₂₄O₄。藏红花酸的主要来源是藏红花的柱头，但是藏红花在自然界中的资源非常有限，其柱头产量更是极低，每一朵藏红花一生只能产出三根雌蕊柱头。平均25万朵藏红花，耗费40个小时的人工提取才能获得足够的柱头生产1kg的藏红花粉(saffron)，含量97％的藏红花酸市场售价高达13.6万元/g，因此藏红花享有“植物黄金”的美誉。

在我国的古典医书中记载，藏红花可以活血化瘀、安神解郁、凉血解毒，而现代医药领域对藏红花的研究也发现藏红花可广泛应用于预防和治疗脑血栓、脉管炎、心肌梗塞、惊悸癫狂等疾病。藏红花酸作为藏红花中的天然活性化合物之一，也因其出色的药理药效被人们所熟知，被广泛用于医药、食品加工及化妆品行业。但是藏红花酸的产量极低，导致了供不应求、市场短缺的现象。

目前，藏红花酸的主要生产方法有天然提取、化学合成以及生物合成。天然提取产量极低，易受产地、气候、采摘处理工艺的影响；化学合成主要通过水解藏红花酸二甲酯得到，副产物多，环境污染严重，所合成的藏红花酸由于其较低的纯度只能作为颜料而不能用作食品添加剂或药物。因此，构建高效的微生物细胞工厂合成藏红花酸是最有前途的生产方法。

1982年，Pfander等阐明了藏红花酸的天然生物合成路径；2003年，ZCD第一次在藏红花中被发现鉴定，被称为7,8(7',8')-玉米黄质裂解双加氧酶；2014年，Frusciante等证明ZCD在大肠杆菌和玉米胚乳中均不能合成藏红花酸，而新发现的藏红花来源的CCD2证实可在玉米黄质的7,8和7',8'处进行催化裂解，合成藏红花酸二醛；2017年，ChaiF等在酿酒酵母中利用藏红花来源的CCD2首次实现了藏红花酸的从头合成，摇瓶发酵产量达633ug/L(Chai F,et al.Heterologous biosynthesis and manipulation of crocetin inSaccharomyces cerevisiae[J].Microbial Cell Factories,2017)，此外该研究还对内源外源ALD进行筛选(藏红花酸产量由240μg/L提至633μg/L)；调节CCD2与ALD的表达强度(藏红花酸产量由633μg/L提至至1219μg/L)。

藏红花来源的CCD2是目前发现的唯一一个能在酿酒酵母中催化玉米黄质合成藏红花酸的CCD家族成员，但文献报道CCD2也不能在其他位点催化β-胡萝卜素和番茄红素，即CCD2可识别的底物谱中不包括β-胡萝卜素和番茄红素；目前，虽然实现了藏红花酸在酿酒酵母中的合成，但通过番茄红素-β-胡萝卜素-玉米黄质-藏红花醛-藏红花酸的长路径天然产物的异源合成面临路径中基因与基因之间、路径基因与底盘之间的适配问题。同时，随着路径的延长，总产率不断降低，产量依旧很低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藏红花来源的CCD2突变体及其编码序列，使得所述CCD2突变体及其编码序列用于构建生产藏红花酸重组酵母菌株时，能够直接以β-胡萝卜素为底物生产藏红花酸和/或提高以玉米黄质为底物生产藏红花酸的效率；