[发明专利]一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用

说明书

本发明公开了一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用。将从土壤中筛到的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC‑H1进行基因组测序分析、克隆CmNAGase、构建重组菌株、表达CmNAGase蛋白、纯化HIS‑TAG，并鉴定重组蛋白具有糖苷水解酶的性质，在高温环境下仍保证良好的酶活性，属于内切酶，且能分别向几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖和几丁六糖的糖链转移一个乙酰氨基基葡萄糖使其糖链长度增加，可通过酶工程、合成生物学对其进行分子改造使该酶的酶促反应的方向朝增加糖链的方向进行，为人工合成几丁寡糖奠定基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用。

背景技术

几丁质又称甲壳素、壳多糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的聚合物，是地球上除纤维素外含量最高的多聚糖。几丁质广泛存在于虾蟹壳、昆虫的外骨骼和真菌细胞壁中，其最终水解产物N-乙酰氨基葡萄糖可以保护软骨组织及骨关节。几丁质酶可以防治植物的真菌类病害，在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有广泛应用。

以几丁质为底物制备N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的方法主要可分为是化学法和酶法，目前工业上多采用化学法，即用强碱脱除乙酰基后，再用强酸水解，使其变成可溶性的氨基葡萄糖（GlcN）。然后再利用化学进行接乙酰基，从而合成GlcNAc。化学法存在反应过程控制较难，伴有副产物产生，且产物的生物活性差等缺陷。此外，在生产过程中涉及到大量强酸强碱，对环境污染严重，三废处理成本高。因此，寻找绿色高效的GlcNAc的制备方法具有重要意义。

几丁质酶是能专一水解几丁质生产GlcNAc及几丁寡糖的糖苷水解酶，因其反应条件温和、控制性强、产物生物活性好且绿色环保，这种生物酶法处理几丁质将成为现代几丁质产业发展方向，具有巨大的发展前景。几丁质酶包括内切几丁质酶（EC 3.2.1.14），外切几丁质酶（EC 3.2.1.20）和EC 3.2.1.201）和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGases，EC3.2.1.52）。几丁质酶将几丁质水解为几丁寡糖，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶将几丁寡糖降解为GlcNAc。

GlcNAc已广泛用于生产唾液酸、生物乙醇和单细胞蛋白质；在医药领域可以作为肠胃炎、骨关节炎的药物，还可应用于癌症诊断。NAGases除了水解N-乙酰基几丁寡糖外，其在细胞O-连接的GlcNAc调节数千种细胞内蛋白质的功能，包括在信号转导，基因表达，细胞周期和蛋白酶体降解中起重要作用 。

氨基酸序列同源性的比较结果显示NAGases属于糖苷水解酶（GH）3,20,73,84和85个家族（http://www.cazy.org /）。本发明的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶GH20家族。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种糖苷水解酶CmNAGase及其克隆表达与应用，该β-N -乙酰氨基葡萄糖酶水解几丁寡糖作用，并具有转糖基的作用。

一种糖苷水解酶CmNAGase，其氨基酸序列如SEN ID NO：2所示。

作为改进的是，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEN ID NO：1所示。

一种重组表达载体，含有所述编码糖苷水解酶CmNAGase基因的核苷酸序列的重组表达载体。

一种重组菌，含有上述糖苷水解酶CmNAGase基因的表达载体的重组菌。