[发明专利]特异性靶向YBX1基因的sgRNAs及其应用

说明书

本发明公开了特异性靶向YBX1基因的sgRNAs及其在提高腺相关病毒产毒效率中的应用。本发明首先获得特异性靶向YBX1基因第一内含子、第三内含子的sgRNAs序列；其次分别构建YBX1基因的两条sgRNAs到慢病毒载体系统，该载体表达Cas9蛋白；同时构建LoxP供体载体质粒，LoxP两端加Cas9剪切位点上下游各800bp的同源臂，LoxP中间添加含有第二外显子的切除片段，最后将三种载体质粒共同转染293T细胞，药筛后获得重组细胞，再转入Cre质粒，获得YBX1第二外显子缺失的敲除细胞株。所获得的YBX1的293T敲除细胞株具有产毒能力明显高于未敲除细胞的优势。本发明具有位点可控、操作步骤简单、sgRNA靶向性好，且对YBX1基因切割效率高；并能明显提高293T细胞的产AAV的能力，为基础研究和临床应用提供更好的细胞工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及特异性靶向YBX1基因的sgRNA及利用该sgRNA并基于CRISPR-Cas9技术改造293T细胞提高腺相关病毒产毒效率的方法。

背景技术

腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector，AAV)属于微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒，具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。然而，较低滴度AAV的生产仍然是限制该技术进一步推广应用的一项挑战。

293T细胞是HEK-293(人胚肾细胞)细胞株插入了SV40T-antigen的温度敏感基因形成的高转染效率衍生株。

YBX1是一个DNA和RNA结合蛋白，参与了几乎所有的DNA和mRNA依赖的过程。YBX1对单链DNA(ssDNA)比双链DNA有更高的亲和力(Hasegawa et al.,1991；Izumi et al.,2001)，尤其是对单链DNA基序GGGG(TT)有最大的结合偏好(zasedateleva et al，2002)。AAV2单链DNAITR区域内126-146核苷酸(包含位于137-142的GGGG(TT)片段)，以及紧跟的125个核苷酸长发夹结构，对AAV基因组DNA的包装是必须的，也因此被作为AAV的包装信号，AAV衣壳蛋白的N端与ITR区域内126-146核苷酸序列的结合，致使AAV单链DNA包入AAV衣壳内(Wang andSrivastava,1997,Xiao et al.,1997)。因此，YB1和AAV衣壳竞争性与ITR126-146核苷酸序列结合，影响AAV基因组的包装效率。最近的报告显示，通过引入shRNA序列下调YB1来建立的239T细胞系，可以使AAV2和AAV8的物理滴度分别增加了45和9倍，AAV2感染基因组的滴度增加7倍。同时发现，YB1基因敲除促进了AAV2rep的表达和载体DNA的产生，减少了AAV2产物中空颗粒的数量。因此，敲除YBX1有助于提高293T细胞生产AAV的效率。

发明内容

为了更好的提高293T细胞产AAV的效率，本研究采用CRISPR/Cas9系统，通过在YBX1基因第二外显子上下游设计全新的sgRNA片段，并通过Cre-LoxP介导的同源重组，删除YBX1的第二外显子，从而特异性的靶向敲除YBX1基因。

本发明的首要目的在于提供用于靶向剪切YBX1基因的sgRNAs、LoxP供体(Donor)质粒、载体、试剂盒、CRISPR-Cas9系统等。

本发明的另一目的在利用上述sgRNAs、LoxP供体(Donor)质粒、载体、试剂盒、CRISPR-Cas9系统等靶向剪切YBX1基因，并提高293T细胞生产AAV的产毒效率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：