[发明专利]重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用、重组载体的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201910246070.8 | 申请日： | 2019-03-29 |
| 公开（公告）号： | CN109868263A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 易吉辉;孙锦霞;袁文娟;许春莲 | 申请（专利权）人： | 深圳精准医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;A61K35/763;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 | 代理人： | 林青中;潘艳丽 |
| 地址： | 518051 广东省深圳市南山区科园*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组单纯疱疹病毒 制备方法和应用 重组载体 构建 位点 应用 | ||
1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位点与缺失的所述ICP47基因的位点上均插入有可溶性PD-1片段。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒的保藏号为CCTCC NO：V201863。
4.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
以p galk载体为模板，采用第一同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-galk片段；将所述ΔICP34.5-galk片段转入感受态的第一重组菌中，进行galk正筛选，得到第二重组菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次连接的ICP34.5基因上游侧翼区序列、galk表达盒及ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第一重组菌中含有携带HSV-1病毒基因组的载体，所述第二重组菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位点上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；
以含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第二同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，将所述ΔICP34.5-hsPD-1片段转入感受态的所述第二重组菌中，进行galk负筛选，得到第三重组菌，所述ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP34.5基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP34.5基因下游侧翼区序列，所述第三重组菌缺失所述ΔICP34.5-galk片段，且缺失的所述ΔICP34.5-galk片段的位点上插入有所述ΔICP34.5-hsPD-1片段；
以所述p galk载体为模板，采用第三同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-galk片段，将所述ΔICP47-galk片段转入感受态的所述第三重组菌中，进行galk正筛选，得到第四重组菌，所述ΔICP47-galk片段含有依次连接的ICP47上游侧翼区序列、所述galk表达盒及ICP47基因下游侧翼区序列，所述第四重组菌缺失ICP47基因，且缺失的所述ICP47基因的位点上插入有所述ΔICP47-galk片段；及
以所述含有可溶性PD-1表达盒的载体为模板，采用第四同源臂引物对进行PCR扩增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，将所述ΔICP47-hsPD-1片段转入感受态的所述第四重组菌中，进行galk负筛选，得到重组载体，所述ΔICP47-hsPD-1片段含有依次连接的所述ICP47基因上游侧翼区序列、所述可溶性PD-1表达盒及所述ICP47基因下游侧翼区序列，所述重组载体缺失所述ΔICP47-galk片段，且缺失的所述ΔICP47-galk片段的位点上插入有所述ΔICP47-hsPD-1片段。
5.根据权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述可溶性PD-1表达盒含有可溶性PD-1片段，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；
及/或，所述第一重组菌的保藏号为CCTCC NO：M2018944。
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