[发明专利]一种单细胞免疫组库测序数据的分析方法

权利要求书

1.一种单细胞免疫组库测序数据的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，对测序仪产生的T/B淋巴细胞基因组序列数据进行数据质量统计与基本质控，以去除含有测序接头、含有未知碱基及低质量的Reads, 筛选出高质量的UMI和高质量的Barcode，得到高质量的reads；

步骤S2, 对步骤S1所得的高质量的reads与参考V(D)J fragments 序列进行序列比对及注释，得到Consensus序列；

步骤S3，对步骤S2拼接得到的Consensus中的CDR3氨基酸序列进行Clonotype分型；

步骤S4，对步骤S3所得样本中的Clonotype进行CDR3、V/J基因、V-J paired特征分析；

步骤S5，将不同样本中的clonotype进行合并，然后进行多样本分析；

所述步骤S2中，序列比对与注释，具体包括：

数据比对：Cell Ranger首先将高质量reads与参考V(D)J fragments 序列进行比对，将至少有15bp比对到该片段区域的paired reads进行保留；

Contig组装：Cell ranger对于通过mapping及UMI的reads可用于进行组装；

Barcode 筛选：Cell ranger对Barcode进行有效性筛选；

组装Contig注释，包括步骤：(1)组装的Contig序列通过Smith-Waterman与germline序列比对，比对到v d j c 区，并进行标记；(2) 序列找起始密码子，寻找CDR3 motif Cys-FGXG/WGXG；(3) 根据以下条件筛选contig标记为productive，条件：跨越v-j区，v区包含起始密码子，包含cdr3区，v-j区不包含终止密码子；

Contig筛选：保留通过Barcode筛选的细胞，并且在Contig注释有2个以上的UMI支持的productive Contig的Contig；

Consensus序列组装注释: 对于Contig筛选后得到的所有Contig进一步拼接，得到样本CDR3支持的Consensus序列。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤S1中，高质量UMI筛选包括步骤：

根据每个UMI的reads支持数，计算Barcode的N50 RPU，在包含50%的reads中，选择最多reads支持的Barcodes，计算第99百分位数的N50 RPU，过滤掉小于第99百分位数的N50 RPU的Barcodes；利用二维高斯混合模型，计算log(N50 RPU per barcode)；将较高均值所在的维度的最小RPU作为阈值，若UMI的RPU在阈值之上，则该UMI为高质量UMI；

所述高质量Barcode筛选的标准为：一个Barcode需要有2个以上的高质量UMI支持。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤S3中，Clonotype分型是CellRanger根据拼接得到的Consensus中的CDR3氨基酸序列进行Clonotype分型，其有效Barcode为该Clonotype的丰度。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤S4中，CDR3特征分析结果用CDR3丰度分布图和CDR3碱基序列长度分布图来展示；

V/J基因特征分析，包括对V/J基因丰度分布情况进行统计分析、CDR3 V/J基因序列长度分布情况统计分析及样本间的V/J基因表达水平进行聚类分析；

V-J paired特征分析，包括对V-J paired 丰度分布和频率分布情况进行统计分析。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤S5中，多样本分析包括样本间Clonotypes比较、 Overlapping Clonotype聚类分析及Overlapping Clonotype差异分析。