[发明专利]一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶ChKRED12耐热性突变体。羰基还原酶ChKRED12可以高效催化制备度洛西汀手性醇等中间体，但热稳定性较差。利用理性设计的方案对该酶进行分子进化，获得的突变体其耐热性大幅度提高，更利于工业应用。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体。

背景技术

羰基还原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.x)是氧化还原酶(Oxidoreductases) 家族中的成员之一，是指能够催化还原羰基生成相应的醇或其逆反应的一类氧化还原酶，其反应的本质为底物和供氢体之间氢或电子的转移。手性醇是一类重要的有机合成砌块，在医药、农业、食品和化工等行业都有很高的应用价值，而羰基还原酶能够催化羰基的不对称还原生成相应的手性醇。

随着工业生物技术和蛋白质工程技术的发展，目前羰基还原酶在手性醇工业生产中的应用已十分广泛。为了适应工业环境下的应用范围，对羰基还原酶的酶学性能提出了更高的要求。其中热稳定性是评价工业生物催化剂的一个重要指标，提高反应温度，可以提高转化率、提升底物可溶性、增加操作弹性等。由于天然蛋白质通常不能承受恶劣的工业环境，大多数只能在温和条件下发挥作用，因此提高酶的热稳定性以使其适应工业应用具有重要意义。分子改造、化学修饰和物理修饰成为目前提高酶热稳定性的三个主要策略。

其中，分子改造是提高酶热稳定性的有效手段之一。在了解酶蛋白结构与功能关系的基础上，通过理性设计，利用定点突变或饱和突变等手段可以快速改造酶蛋白。目前应用比较成功的理性设计方法主要包括同源比对、脯氨酸效应设计、基于二硫键设计和表面电荷优化等。已有许多学者运用这些技术成功地改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展。

羰基还原酶ChKRED12能够催化度洛西汀手性醇中间体(中国专利，CN104830924A)，以及手性单羟基衍生化的1,2-醇类化合物(中国专利， CN108753851A)等，且能够耐受较高的底物浓度、具有较高的催化效率，是一个很有潜力的酶，然而其热稳定性较差，限制了工业应用。因此，通过分子改造提高该酶的耐热性，具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：羰基还原酶ChKRED12热稳定性差的问题。为此，本发明公开了一种羰基还原酶ChKRED12热稳定性提高的突变体。

该突变体具有如下特征：

以SEQ ID NO.2为出发序列，将第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(S79P)，或者将第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(L128M)，或者将第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V162I)，或者将第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(G163A)，或者以上四个位点的任意组合得到的突变体。

根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明的技术方案为：

以理性设计的方法，识别羰基还原酶ChKRED12(氨基酸序列为SEQ ID NO.2) 热稳定性相关的氨基酸位点，利用定点突变技术进行单点突变和组合突变，从而得到热稳定性提高的突变体酶。

本发明的具体步骤为：

(1)羰基还原酶ChKRED12热稳定性相关位点的预测：该酶的基因序列和氨基酸序列已公开(基因序列NCBI登录号为KC342012；氨基酸序列NCBI 登录号为AHC30850.1，即SEQID NO.2)。