[发明专利]基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

(1)石墨烯修饰电极的制备

将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；

(2)为了提高修饰电极的稳定性，将步骤(1)制得的修饰电极继续滴涂壳聚糖乙酸溶液；

(3)电极上氧化石墨烯的电化学还原

将步骤(2)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对钙卫蛋白抗体的吸附性能，增大钙卫蛋白抗体在电极上的吸附量；

(4)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺活化电极表面的羧基

将4～6μL的含有50～600mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液滴涂到步骤(3)制得的修饰电极上，并在室温下活化1～3小时；

(5)修饰钙卫蛋白抗体

将5～7μL浓度为25～300μg/mL的钙卫蛋白抗体溶液滴加到步骤(4)制得的电极表面，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液洗去未与电极结合牢固的钙卫蛋白抗体；

(6)封闭电极非特异性活性位点

用4～6μL浓度为0.5～3wt％的牛血清白蛋白溶液封闭步骤(5)制得电极的表面非特异性活性位点，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极结合牢固的牛血清白蛋白；

(7)修饰钙卫蛋白

将5～7μL浓度为10～200ng/mL的一系列不同浓度的钙卫蛋白用于和电极上抗体特异性识别，于25～35℃恒温箱中孵化0.5～2小时，用8～12mM的磷酸盐缓冲溶液清洗掉未与电极上抗体结合牢固的钙卫蛋白，于4℃冰箱中储存备用。

2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为0.5～20μL。

3.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.5～3mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯分散液用量为2～15μL。

4.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(2)中，壳聚糖乙酸溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖乙酸溶液。

5.根据权利要求1所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的制备方法，其特征是，步骤(4)中，N羟基琥珀酰亚胺在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为100～200mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为200～500mM。

6.一种权利要求1至5之一所述方法制备的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，其特征在于，钙卫蛋白生物传感器用于检测钙卫蛋白，包括检测粪便中的钙卫蛋白、血清中的钙卫蛋白或尿中的钙卫蛋白。

7.根据权利要求6所述的基于石墨烯的钙卫蛋白生物传感器的应用，其特征在于，石墨烯修饰电极传感器对钙卫蛋白溶液浓度的检测过程如下：

将修饰有钙卫蛋白的电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，以溶解于磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为1～3mM的铁氰化钾溶液为电解液，在电化学工作站上在-0.2～0.6V电压范围内做循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描，在循环伏安扫描或差分脉冲伏安扫描曲线上的峰电流随钙卫蛋白浓度呈规律性变化，从而实现对钙卫蛋白浓度的检验。