[发明专利]稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株及其构建和应用

说明书

本发明涉及稳定表达MAP3K8蛋白的BHK‑21细胞株及其构建和应用。该细胞株命名为BHK‑21/MAP3K8，保藏编号为CCTCC NO:C2018261。细胞株制备：目的基因MAP3K8合成，重组慢病毒载体Lv‑MAP3K8构建，包装表达MAP3K8的慢病毒，慢病毒感染BHK‑21细胞，经筛选、培养和鉴定获得稳定表达MAP3K8蛋白的BHK‑21细胞株。和BHK‑21相比较，BHK‑21/MAP3K8细胞株更有利于FMDV或SVV复制，更适合FMDV或SVV疫苗的研制和生产，同时为研究MAP3K8的基因功能提供了可靠材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定表达MAP3K8蛋白的BHK-21细胞株及其构建和应用。

背景技术

稳定表达是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录、表达和传代，细胞中目的蛋白的表达持久、稳定。一般是将外源DNA克隆到具有某种抗性或选择基因的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中，但外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组和连接，形成巨大的结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供，如用载体中所含有的选择标志进行筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。

BHK-21细胞系(Baby Hamster Syrian Kidney)是从叙利亚幼鼠肾组织中分离培养获得的成纤维型贴壁细胞系，其可连续传代。BHK-21细胞系可以用于多种病毒的增殖和纯化。如口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)、脑心肌炎病毒(EMC Virus)、呼肠孤病毒(Reoviridae)、水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)和塞内卡古病毒(Seneca valley virus,SVV)等。目前BHK-21细胞系已被广泛应用于口蹄疫疫苗生产。

有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，简称MAPK)是一类丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine，简称Ser/Thr)蛋白激酶家族，可以被多种细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应激和细胞粘附等信号激活，是免疫、癌变和细胞凋亡途径的调节剂。MAPK信号通路在进化上是高度保守的，并在基因表达调控及巧胞质巧信号传递过程中发挥着重要作用，如病原诱导宿主保护性反应。MAP3K8又称TPL2(tumorprogression locus 2)/COT(cancer Osaka thyroid)，在不同的组织中都有着广泛的表达。

有研究表明TPL2通过上调裂解基因表达和病毒裂解基因的启动子活性(包括RTA和开放阅读框57(ORF57))来增强MHV-68裂解复制，TPL2/AP-1信号转导途径为MHV- 68裂解复制的正调节物；另外MAP3K8/Tpl2还能促进鼠γ疱疹病毒的复制(Li,X.；Feng,J.； Chen,S.et al.Tpl2/AP-1enhances murine gammaherpesvirus 68lytic replication.J Virol2010,84 (4),1881-1890.)。魏楠楠等根据GenBank公布的TPL2基因序列设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列，利用脂质体方法转染BHK-21细胞，结果表明，FMDV感染BHK-21细胞后，TPL2转录水平显著上调；过表达TPL2能够促进FMDV 在BHK-21细胞中复制，而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制(魏南南,徐守兴,史喜娟,etal.TPL2促进口蹄疫病毒在BHK-21细胞复制[J].畜牧兽医学报,2018, 49(6).)。