[发明专利]一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，公开了一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法。本发明采用Accutase酶消化成团细胞，消化结束后用无血清培养基中和消化酶，然后用无血清培养基重悬细胞，获得悬浮细胞。本发明的方法一方面能够快速和有效的使成团细胞悬浮，缩短了驯化悬浮细胞的时间，还最大程度的保持了细胞活性；另一方面采用无血清培养基，培养基成分明确，不含任何外源血清成分，显著的提高了细胞的增殖能力和稳定性，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法。

背景技术

哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业生产重组蛋白、病毒疫苗等生物制品的有效方法，在我国传统细胞培养采用贴壁细胞培养方式。这种方式虽然操作简便，但由于转瓶表面积有限，细胞密度低，造成产品产量低下，并且培养时需要加入血清，由于血清化学成分不确定，批间差异大，可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，血清的使用不仅增加了成本的投入，而且增加了产品的不稳定性和下游纯化的困难。由此，实现哺乳动物细胞的无血清悬浮培养，对于提高产能，降低成本，简化下游生产具有重要意义。

贴壁细胞悬浮驯化的通用方式是逐渐降低培养基血清含量使细胞逐渐适应无血清悬浮培养基，以此通过驯化，使多种哺乳动物细胞从贴壁状态成为可悬浮生长于无血清的培养基中的细胞系，使得单位体积内能生长更多的细胞。但驯化后的悬浮细胞，培养到一段时间会在培养液中出现细胞聚集结团的现象，在更换其他培养基进行培养的条件下，也会产生成团的现象。出现细胞成团有以下几个因素：(1)细胞在培养过程中，出现细胞活率下降，细胞死亡率增高，细胞破裂后释放到悬液中的DNA会引起悬液中的细胞逐渐成团；(2)无血清培养基中的Ca²⁺离子浓度、硫酸葡聚糖钠浓度、肝素钠浓度等成分会对细胞成团有一定的影响，尤其硫酸葡聚糖钠和肝素钠在培养基中所发挥的作用是抗细胞聚集，随着培养基中细胞密度的增大，当营养液中的细胞密度增大到一定密度时(如HEK293细胞密度达到3～5×10⁶cells/ml)，营养液中的抗细胞聚团的成分对细胞的抗聚团作用会降低，从而使得相互聚集的细胞会逐渐增多；(3)悬浮细胞未完全驯化成悬浮状态，导致培养过程中细胞成团。针对悬浮细胞在培养过程中再次成团的问题，通常采用的解决方式有两种方法，第一种方法是使用胰酶重悬和消化细胞，利用含2％FBS(DMEN)终止胰酶消化，然后再用无血清细胞营养液重悬细胞；第二种方法是重头开始驯化，采用胰酶消化并逐级降低培养基血清含量，从含有10％FBS至含有1％FBS，当细胞适应含有1％FBS的培养基几代后，DMEN与无血清培养基逐级按95％-90％-75％-50％-25％-10％-5％-0％最终适应完全无血清培养基。上述两种方法都是利用胰酶进行再次消化，通过多次换液和频繁分种使成团细胞通过再驯化重新成为悬浮细胞。然而在已经驯化成悬浮状态后再次成团的细胞非常脆弱，对外界环境非常敏感，当细胞出现聚集成团现象后，再次利用传统的方法制备成单个悬浮细胞培养状态，其驯化时间长达一个月并且细胞容易受到消化酶的损伤而导致活力降低，再加上胰酶的活性需要用胎牛血清来中止，这样不可避免的在细胞培养过程中引入了血清成分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对悬浮驯化后的细胞再次聚集成团后，消化成团细胞，使细胞再次成为单个游离的悬浮细胞，使所制备的悬浮细胞能够在无血清培养基中存活和健康生长，在后续放大培养中不出现细胞成团的现象。

鉴于上述问题，本发明提供了一种成团细胞悬液快速优化制备悬浮细胞的方法。

作为优选，所述方法的步骤为：采用Accutase酶消化成团细胞，消化结束后中和消化酶，然后用无血清培养基重悬细胞，获得悬浮细胞。

作为优选，在采用Accutase酶消化成团细胞前还包括对Accutase酶进行稀释的步骤。

作为优选，采用不含Ca²⁺和Mg²⁺的溶液对Accutase酶稀释5倍以上。