[发明专利]一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用

说明书

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用。本发明以壳聚糖为载体材料，MgSOsubgt;4/subgt;、三聚磷酸钠作为交联剂，通过离子交联法制备出新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。该疫苗表面没有明显的空隙，呈良好规则的圆形，具有良好的分散性，且没有聚集和沉降损伤，平均粒径为240.8±7.4nm，Zeta电位为25.0±1.5mV，纳米颗粒的包封率为92.3±0.56％。可点眼滴鼻免疫诱导黏膜免疫应答，可较好用于鸡新城疫免疫，且成本低，为新型的DNA疫苗研制奠定基础。

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用。

背景技术

新城疫称为伪鸡瘟、亚洲鸡瘟，具有高致病性、高死亡率，是一种由新城疫病毒引起禽类发病、致死的急性、高度接触性的世界范围性传染病，主要以感染鸡与火鸡为主。自1926年在英国新城分离到新城疫病毒以来，经过4次世界范围的大流行后，宿主范围不断扩大，基因VII型，尤其是VIId亚型毒株的流行，给整个养禽业造成了重大的经济损失，并且目前没有一种有效的药物对其进行治疗。目前我国对于新城疫的防治主要采用各种不同毒力的弱毒疫苗或油乳剂灭活苗等传统疫苗进行免疫，但某些弱毒苗保留了部分毒性，对雏鸡有一定的呼吸道病变和致死率，另外也增强了其它病原体的易感性，其次受免疫途径的影响，产生循环抗体低，维持期短；灭活苗虽然能产生高水平的循环抗体，但在抵抗消化道与呼吸道病原感染的黏膜系统中难以发挥较好的作用，而且需要注射器免疫，费时费力，残留一些注射器对环境有害。因此寻求一种廉价、安全、有效且方便的疫苗对新城疫的综合防治有重要的意义。

DNA疫苗是指将能够表达病原主要抗原的真核表达载体，通过一定的途径进入动物体内，利用宿主细胞进行转录和翻译来产生抗原蛋白，刺激机体免疫应答反应，从而起到免疫保护的作用。F蛋白是NDV的主要毒力因子与保护性抗原，单独的F基因构建的DNA疫苗通过普通的肌肉注射难以达到理性的保护效率，因此，对分子佐剂和免疫途径需要进行进一步探讨。在过去的很多年，纳米技术被广泛的用于疫苗的研究中，应运产生了纳米疫苗。其中壳聚糖是一种安全可靠的碱性天然生物活性多糖，其来源丰富、生物相容性好、可降解和分解产物无毒，并且其粒径小，表面积大，与生物膜有较高的黏着性等优点，已成为广泛应用的新型药用辅料之一，作为微球、微囊、纳米粒等药物载体的研究也日益受到重视。国内DNA纳米颗粒疫苗黏膜免疫系统的研究工作开展很少，而新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的研究尚未见有报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。

本发明的再一目的在于提供上述新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法，包含如下步骤：

(1)将pH为4.5～6.5、壳聚糖浓度为0.5～1.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液600～900rpm磁力搅拌5～10min；然后逐滴加入浓度为250～1000ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；再加入pH为4.5～6.5、MgSO₄/浓度为0.5～1.5mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；最后加入pH为4.5～6.5、TPP浓度为0.5～1.5mg/mL的TPP/乙酸溶液，700～1000rpm磁力搅拌30～40min；

(2)搅拌反应后，低温离心，弃上清，收集沉淀；

(3)采用预冷的ddH₂O重悬沉淀，混匀，超声破碎，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；