[发明专利]牛繁殖系统及胚胎组织定量PCR检测内参基因筛选及应用

说明书

本发明公开了一种牛繁殖系统及胚胎组织定量PCR检测内参基因筛选及应用，涉及动物分子生物学技术领域。本发明为妊娠奶牛繁殖系统及胚胎组织的基因表达研究筛选出合适的内参基因，为妊娠奶牛繁殖系统及胚胎组织基因表达的荧光定量PCR检测的准确性提供有力保障，有助于进一步研究奶牛胚胎发育的调控机制以及母体‑胎儿互作的基本规律，为深入理解妊娠识别和妊娠建立相关分子机理提供重要理论支持，为采取人工干预手段减少奶牛的早期妊娠失败提供理论依据。

技术领域

本发明涉及动物分子生物学技术领域，具体是涉及一种牛繁殖系统及胚胎组织定量PCR检测内参基因筛选及应用。

背景技术

荧光定量PCR技术是研究mRNA表达水平的一种常用方法，具有定量准确、灵敏度高、重复性好、特异性强以及批量操作等优点。但是，荧光定量PCR数据分析的准确性和重复性取决于所采用的标准化方法。在基因表达分析中，通常会选择合适的内参基因对目的基因进行校正和标准化进而提高该方法的灵敏度和重复性。理想的内参基因是在各种试验条件和影响因素下，能在各种类型的组织或细胞中稳定表达。因此，在应用荧光定量PCR分析基因表达的研究时，必须根据不同样品、不同的试验条件，选择相对合适的内参基因及其数量对数据分析进行校正和标准化，才能对目的基因表达进行准确可靠的定量，获得真实可信的试验结果。

产奶性状是奶牛的重要经济性状，产奶的前提是成功妊娠并产犊，因此，提高奶牛的妊娠率已成为养殖场繁殖工作的重点。奶牛配种后的受精率达90％以上，然而实际产犊率为35-55％，妊娠失败主要发生于妊娠的前3个月，包括配种后0-7天，8-27天，28-60天以及61-90天这四个阶段。其中，高产奶牛的妊娠丢失主要集中在前三个阶段，其妊娠丢失率分别为20-50％、30％以及12％。妊娠奶牛是研究胚胎发育以及母体-胎儿互作的常用素材，加强对奶牛繁殖系统以及胚胎组织中基因表达的研究，有助于进一步揭示胚胎发育的调控机制以及母体-胎儿互作的基本规律，为深入理解妊娠识别和妊娠建立相关分子机理提供新的重要线索。然而，目前常用内参基因在妊娠奶牛繁殖系统及胚胎组织的荧光定量PCR检测中的表达稳定性尚未得到确认。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种牛繁殖系统及胚胎组织定量PCR检测内参基因筛选及应用，为妊娠奶牛繁殖系统及胚胎组织基因表达的荧光定量PCR检测的准确性提供有力保障。

本发明提供一种牛繁殖系统及胚胎组织定量PCR检测内参基因筛选方法，包括以下步骤：

提取妊娠奶牛的繁殖系统及胚胎组织的RNA，并反转录；

选择若干候选内参基因，进行荧光定量PCR反应，制作标准曲线；

根据标准曲线、扩增效率和决定系数，判断引物扩增效率的高低，以及模板浓度与Ct值之间的线性关系；

对候选内参基因的表达稳定性进行分析，将表达稳定性最优的候选内参基因作为筛选出的内参基因。

在上述方案的基础上，所述候选内参基因包括SUZ12、C2orf29、ACTB、RPL19、RPS9、GAPDH、TBP、HPRT1、PPIA和SDHA。

在上述方案的基础上，采用geNorm、Normfinder和Bestkeeper程序分别对候选内参基因的表达稳定性进行分析。

在上述方案的基础上，采用geNorm程序对候选内参基因的表达稳定性进行分析，具体包括以下步骤：

导入QPCR所获得的Ct值；

通过计算候选内参基因表达稳定度的平均值M，判定各候选内参基因的表达稳定性；

并对各候选内参基因进行配对变异分析；

采用Normfinder程序对候选内参基因的表达稳定性进行分析，具体包括以下步骤：