[发明专利]一种快速鉴定CRISPRC/cas9阳性克隆载体的方法

说明书

本发明的快速鉴定CRISPRC/cas9阳性克隆载体的方法，采用PCR验证方法替代测序方法，其中PCR所使用的一对引物中，有一条来源于gRNA的正链或负链oligo。另一条引物来源于gRNA的上游或下游序列。通过这样一对引物进行验证，可以快速筛选到阳性克隆载体，并且可以完全替代测序验证的方式。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种快速鉴定CRISPRC/cas9阳性克隆载体的方法。

背景技术

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，是一种来自细菌降解 入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成 3 类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR 相关蛋白（Cas 蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统 只需要一种 Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

目前，来自 Streptococcuspyogenes 的 CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含 有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA 两条单链。Cas9 首先与 crRNA 及tracrRNA 结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成 RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9 系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

此系统的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 sgRNA（singleguide RNA ），足以引导 Cas9对DNA的定点切割。

作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（Cas9 nuclease-null） 融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。由于crRNA 参与并且起到精确导向的作用，所以 CRISPR／Cas9 打靶系统也被称为 RNA 导向(RNA guided) 打靶系统。

因此在执行CRISPR-Cas9 系统进行生物体基因组编辑时，都需要设计有效的sgRNA，并将其克隆到CRISPR-Cas9基因敲除的载体中。这里，我们开发了一个不需要通过测序就可以确认CRISPR-Cas9阳性敲除载体的方法。可以节省成本和至少2天的时间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是快速筛选CRISPR-Cas9阳性敲除载体的方法。 本发明的快速筛选CRISPR-Cas9阳性敲除载体的方法，所述敲除载体为CRISPR/Cas系统中的任何一种敲除载体。

本发明的快速筛选CRISPR-Cas9阳性敲除载体的方法，步骤如下：

一、根据要敲除的基因，通过在线软件设计合适的gRNA