[发明专利]一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法

说明书

本发明涉及植物组织培养领域，具体是指一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，包括培养无菌苗、诱导愈伤组织、高压灭菌、悬浮培养愈伤组织、干燥五个步骤，是一种规模化生产天山雪莲培养物的方法，可在保证绿原酸和紫丁香苷含量的基础上，稳定高产天山雪莲培养物；利用液体培养基进行悬浮培养，不仅可以扩大愈伤组织的数量，还能有效缩短时间。

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，特别涉及一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法。

背景技术

天山雪莲含有黄酮、生物碱、多糖等多种有效成分，具有活血通经、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效。近年来，天山雪莲作为民族药和民间药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用备受关注。

天山雪莲因其生境特异，自然繁殖率较低，生长缓慢，人工栽培困难，长期以来掠夺性采挖使雪莲野生资源面临灭绝的危险。1996年中国已将天山雪莲列为二级保护植物，天山雪莲是唯一列入《中国植物红皮书》的雪莲植物，是中国国家三级濒危物种。2000年国务院13号文件已明令禁止采挖野生雪莲。

利用植物组织培养技术，高效培养富含活性成分的天山雪莲培养物，是解决天山雪莲资源短缺的有效途径，一方面解决了天山雪莲资源不足的问题，另一方面提高了有效成分的含量。

利用植物组织培养技术，特别是悬浮培养技术，可生产出符合《中国药典(2015版)》规定的绿原酸含量和紫丁香苷含量的愈伤组织，可实现规模化生产。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，其快速、稳定。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种天山雪莲愈伤组织的悬浮培养方法，包括如下步骤：

(1)培养无菌苗：将天山雪莲种子做灭菌处理，将无菌种子用25℃的无菌水浸泡24h，接种在湿润的、无菌的、带滤纸的培养皿中萌发；

(2)诱导愈伤组织：将无菌苗的叶、根和茎转接至添加有植物激素的MS培养基上，在培养室诱导愈伤组织生长；

(3)高压灭菌：将装有25～50mL无菌悬浮培养液的锥形瓶，在120℃温度下高压灭菌16～18min；

(4)悬浮培养愈伤组织：将雪莲愈伤组织剪碎成颗粒，置于无菌悬浮培养液的锥形瓶中，然后放在摇床中，在转速为80～110r/min、温度为23～27℃、光照为8～14h/d的条件下培养15～25天，然后更换新的15～100mL悬浮培养液，继续培养10～30天；

(5)干燥：培养结束后，过滤分离得到愈伤组织，用蒸馏水洗2遍以上，置于30～55℃烘箱中烘干至恒重，即得干燥愈伤组织。

作为优选的，天山雪莲种子灭菌处理的方法为：使用70％乙醇处理30s，然后用0.1％升汞处理10min，最后用无菌水清洗4次。

作为优选的，培养无菌苗时，培养室的温度为15～20℃，室内相对湿度为50％～70％，光照强度为1000～1500lx。

作为优选的，诱导愈伤组织时，培养室的温度为18～22℃，相对湿度为50％～70％，光照为12h/d，光照强度为1000～1500lx。

作为优选的，诱导愈伤组织时，MS培养基上添加量的植物激素为：0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的NAA。

作为优选的，高压灭菌时，愈伤组织颗粒的直径为0.3～3.0mm，分散浓度为5～50个颗粒/mL。

作为优选的，悬浮培养愈伤组织时，悬浮培养液为添加有0.1～1.0mg/mL的6-BA与1.0～3.0mg/mL的MS液体培养基，悬浮培养液pH＝5.5～7.0。