[发明专利]一种散射荧光双模态流式成像系统

说明书

本发明提供一种散射荧光双模态流式成像系统，包括具有激发光源和光束整形模块的多色正交照明单元，包括物镜、多光谱分像器和多个相机的多通道显微成像单元，以及与所述物镜共轴的进样管。所述激发光源能够发射两个或多个波长的激发光，经所述光束整形模块整形后，在与所述物镜焦面重合的位置处垂直照射所述进样管。所述物镜收集生物颗粒发出的散射光和荧光，所述多光谱分像器按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及一个或多个荧光通道投射至不同的相机进行成像。整套系统原理基于光片照明的侧向散射和荧光发射显微成像技术，能够取得更准确的浮游生物观测结果，并适应更广谱的水域浮游生物物种范围和非生命颗粒物的在线测量需求。

技术领域

本发明属于生物及环境领域的光学仪器技术，具体涉及到一种流式成像系统。

背景技术

浮游生物是水域生态系统的基础组成部分，在整个食物链物质循环和能量流动中起到重要的作用。对浮游生物的生理、生态、多样性和过程了解是海洋资源、生物多样性、生态系统对气候变化响应等研究的基础需求。然而，尽管现有浮游生物观测技术和观测平台已有一定发展，但是识别与定量技术在检测的通量、特异性与准确性上仍然严重不足，是目前与未来相关科学研究和水环境监测需要面对的主要挑战之一。

水域环境除了具有广阔性，还掺杂有大量与浮游生物尺度类似的非生命颗粒物。这与浮游生物的微小性、异质性构成天然矛盾，造成对浮游生物大时空尺度准确观测的巨大挑战。各种观测技术的最终目的是对海洋浮游生物的分布、丰度、种群结构、大小或生物量进行及时准确的测量或估计。然而现有技术均难以突破观测准确性和通量间的矛盾，亟需从检测方法原理上寻求突破，发展通量更高、检测更准、可在现场工作的分析技术和仪器。

迄今为止，基于形态学的光学镜检仍然是最为广泛使用的浮游生物鉴定和分析经典方法。随着数字技术的进步，将高速数字成像与计算机人工智能结合，将有可能大幅提升镜检通量，获得更准确、更客观、更高效、更可重复的浮游生物观测结果。这一思想催生了成像流式细胞测量术(imaging flow cytometry)的诞生与发展。

这一技术结合了光学显微镜与传统非成像流式细胞仪的原理与优势，可在细胞流动中高通量获取其二维图像。相比人工/自动镜检，它的进样和成像速度更快，检测通量大幅提升；相比非成像流式细胞仪，它获取的细胞形态细节信息更丰富，更接近广泛使用的经典形态学镜检。

然而，现有成像流式细胞测量术在应用于天然水样中的浮游生物检测分析时，仍有很多缺陷和不足。例如，FlowCAM和Imaging Flow CytoBot(IFCB)是两种专用于浮游植物观测的成像流式细胞仪系统。两种仪器的显微摄影均基于明场成像原理，在拍摄高速流动细胞时，受到离焦模糊和拖尾模糊的困扰，难以同时对较大粒径范围内的细胞清晰成像。由于两种仪器难以应用高倍物镜，导致成像分辨率和灵敏度较差，检测2μm内的细胞困难。为了避免拖尾模糊，上述仪器均采用了闪光照明的方法提高快门速度“抓拍”细胞；但是曝光时间的大幅缩短导致图像信噪比恶化，降低测量精度。此外，上述仪器会在高流速时漏拍细胞，在低流速时出现同视野重复拍摄，造成严重的统计误差。Amnis系列成像流式细胞仪采用时间延时积分成像技术，可对细胞同时实现明场、暗场和荧光多光谱流式显微成像。相比于明场成像，可在细胞形态信息基础上额外获取更为丰富的生化信息用于比对分析。但是在时间延时积分成像中，细胞流动与相机的曝光读出需要通过复杂的测速反馈机制精确同步，否则仍会造成拖尾模糊；通过后期计算拓展有效景深的方法增加了仪器复杂度和成本，图像后处理操作也会占用大量处理时间，降低了流式成像测量的有效通量。目前该仪器的常规放大倍率为40倍，进样通道尺度仅为120μm，在实际使用中容易堵塞。由于该仪器的设计初衷是为实验室内生物医学细胞的检测，因此并不适用于对成分复杂的天然水样进行直接分析，更不可能用于水域现场环境。